Habari

Asante kwa kutembelea Nature.com.Toleo la kivinjari unachotumia lina uwezo mdogo wa kutumia CSS.Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime Hali ya Upatanifu katika Internet Explorer).Wakati huo huo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tutatoa tovuti bila mitindo na JavaScript.
Seli za saratani zimeunda mifumo mbali mbali ya kushinda mafadhaiko ya seli na kuendelea kusonga mbele.Protein kinase R (PKR) na kiamsha protini chake (PACT) ndio viitikio vya awali ambavyo hufuatilia ishara mbalimbali za mfadhaiko zinazosababisha kuzuiwa kwa kuenea kwa seli na apoptosis.Walakini, udhibiti wa njia ya PACT-PKR katika seli za saratani bado haijulikani kwa kiasi kikubwa.Hapa, tuligundua kuwa RNA (lncRNA) ndefu isiyo na msimbo ya RNA (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) inahusika moja kwa moja katika uzuiaji wa njia ya PACT-PKR na inakuza kuenea kwa seli za saratani.Kwa kutumia uchunguzi mkubwa wa utendaji wa CRISPRi 971 lncRNA inayohusishwa na saratani, tuligundua kuwa DARS-AS1 ilihusishwa na kuongezeka kwa seli za saratani.Kwa hiyo, mtoano wa DARS-AS1 huzuia kuenea kwa seli na kukuza apoptosis ya seli za saratani katika mistari mbalimbali ya seli za saratani katika vitro na hupunguza kwa kiasi kikubwa ukuaji wa tumor katika vivo.Kimitambo, DARS-AS1 hufunga moja kwa moja kwa kikoa cha kuwezesha PACT na kuzuia mwingiliano wa PACT-PKR, na hivyo kupunguza uanzishaji wa PKR, phosphorylation ya eIF2α, na kuzuia kifo cha seli ya apoptotic.Kliniki, DARS-AS1 inaonyeshwa sana katika saratani nyingi, na kujieleza kupita kiasi kwa lncRNA hii ni dalili ya ubashiri mbaya.Utafiti huu unafafanua udhibiti mahususi wa saratani wa njia ya PACT-PKR na DARS-AS1 lncRNA na hutoa lengo lingine la ubashiri na matibabu ya saratani.
Uwezo wa kukabiliana na dhiki ni sifa muhimu ya maisha ya seli za saratani na kuenea.Kuenea kwa kasi na alama za kimetaboliki za kilele cha saratani katika mazingira magumu-upungufu wa virutubisho, hypoxia, na pH ya chini-ambayo inaweza kusababisha njia za kuashiria kifo cha seli.Upungufu wa jeni zinazohimili mkazo kama vile p535, protini za mshtuko wa joto 6, 7, KRAS8, 9, na HIF-110, 11, 12, 13 huzingatiwa mara kwa mara katika saratani, na hivyo kuzuia apoptosis na kukuza maisha.
Protein kinase R (PKR) ni kihisi muhimu cha mkazo na subunit kinase ya kipengele cha kuanzisha yukariyoti 2α (eIF2α), kidhibiti cha utafsiri ambacho huunganisha mkazo wa seli na kifo cha seli.PKR awali ilitambuliwa kama protini ya kuzuia virusi kwa kugundua RNA ya kigeni yenye nyuzi mbili (dsRNA).Baada ya kuanzishwa, PKR phosphorylates eIF2α ili kuzuia usanisi wa protini ya virusi na seli14,15,16.PACT (protini ya kiamsha cha PKR) imetambuliwa kuwa protini ya kuwezesha PKR ya kwanza bila dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Kupitia mwingiliano wa moja kwa moja na PKR, PACT hupitisha mikazo mbalimbali (njaa ya serum, peroxide au matibabu ya arsenite) hadi PKR na njia za kuashiria chini ya mkondo.Kando na phosphorylation ya eIF2α, uanzishaji wa PKR inayopatanishwa na PACT huanzisha matukio mbalimbali yanayohusiana na jibu la dhiki, ikiwa ni pamoja na kubadilishwa kwa hali ya redox kupitia njia ya PI3K/Akt24, ukaguzi wa uharibifu wa DNA ulioimarishwa kupitia p5325,26 na NF-κB27,28 Hudhibiti unukuzi, 29. Kwa kuzingatia jukumu lao muhimu katika kukabiliana na mafadhaiko, kuenea, apoptosis na michakato mingine muhimu ya seli, PKR na PACT wanaahidi malengo ya matibabu kwa magonjwa mengi, haswa saratani30,31,32,33.Hata hivyo, licha ya umuhimu huu wa kiutendaji na kibiolojia, udhibiti wa shughuli za PACT/PKR katika seli za saratani bado haujaeleweka.
lncRNA ni nakala kubwa kuliko nyukleotidi 200 zisizo na uwezo wa kusimba protini.Kwa kuwa miradi ya kisasa ya kupanga mpangilio wa jenomu imebainisha maelfu ya lncRNAs, 35,36 juhudi nyingi zimefanywa ili kufafanua kazi zao za kibaolojia.Utafiti unaokua umeonyesha kuwa lncRNAs zinahusika katika michakato mingi ya kibiolojia37 ikiwa ni pamoja na udhibiti wa kutofanya kazi kwa kromosomu ya X38,39, imprinting40, transcription41,42, translation43 na hata ukuaji wa saratani44,45,46,47.Masomo haya yaliripoti kuwa lncRNA nyingi zinahusika katika njia ya PACT/PKR.Utafiti mmoja kama huo ulionyesha kuwa lncRNA ASPACT ilizuia unukuzi wa PACT na kuongeza uhifadhi wa nyuklia wa PACT mRNA.Uchunguzi mwingine umeonyesha kuwa lncRNA nc886 hufunga kwa PKR na kuzuia phosphorylation49,50 yake.Kufikia sasa, lncRNA inayodhibiti uanzishaji wa PACT-mediated PKR haijaripotiwa.
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) imetambuliwa kuwa lncRNA51,52,53,54 ya oncogenic.Kupitia udhibiti wa miP-194-5p53, miP-12952 na miP-532-3p51, DARS-AS1 imeonyeshwa kukuza ukuaji wa saratani ya seli ya wazi ya figo, saratani ya tezi na saratani ya mapafu ya seli isiyo ndogo, mtawalia.Tong na wenzake pia waligundua kuwa DARS-AS1 inakuza maendeleo ya myeloma kwa kudumisha uthabiti wa motifu ya kumfunga protini 39 (RBM39) RNA.Walakini, hakuna tafiti ambazo zimefanywa kuhusu ikiwa lncRNA hii inahusika katika udhibiti wa uanzishaji wa PACT-PKR na mwitikio wa mkazo wa seli za saratani.
Hapa, tulifanya skrini kubwa ya kupoteza kazi kwa kutumia mfumo wa CRISPRi na tukaamua kuwa DARS-AS1 lncRNA inakuza kuenea kwa aina kadhaa za seli za saratani.Kwa kuongeza, tumetambua utaratibu mkuu: DARS-AS1 hufunga moja kwa moja kwa PACT, huzuia kuunganisha kwa PACT na PKR, kuzuia phosphorylation ya eIF2α, substrate ya chini ya PKR, na hatimaye kuzuia kifo cha seli ya apoptotic.Kwa kumalizia, kazi yetu inafichua DARS-AS1 lncRNA kama kidhibiti cha njia ya PACT-PKR na lengo linalowezekana la matibabu na ubashiri wa saratani.
Uchunguzi wa kina wa wasifu wa genomic umegundua mamia ya lncRNAs zinazohusiana na saratani.Hata hivyo, kazi yao bado haijajulikana56.Ili kutambua watahiniwa wa kuahidi wa lncRNA wanaohusika katika maendeleo ya saratani, tulifanya skrini ya kupoteza-kazi kwa kupungua kwa kuenea katika mstari wa seli ya saratani ya colorectal ya SW620 kwa kutumia mfumo wa CRISPRi (Mchoro 1a).Kipengele cha pekee cha mistari ya seli za saratani ya koloni ya SW480 na SW620 ni kwamba zinatokana na uvimbe wa msingi na wa sekondari katika mgonjwa mmoja.Hii hutoa kulinganisha kwa thamani kwa kusoma mabadiliko ya maumbile katika maendeleo ya saratani ya koloni ya hali ya juu.Kwa hivyo, tulichanganua nakala za mistari ya seli za saratani ya colorectal (SW480 na SW620) kwa kutumia mpangilio wa RNA na tukakusanya baadhi ya lncRNA zinazoweza kufanya kazi kutoka kwa fasihi iliyochapishwa.Kulingana na matokeo haya, tulitengeneza maktaba iliyojumuishwa ya sgRNA iliyo na oligos 7355 sgRNA inayolenga lncRNAs 971 zinazohusiana na saratani na oligos 500 ambazo hazijalengwa za sgRNA kwa udhibiti hasi (Data ya Ziada 1).
Uwakilishi wa kimkakati wa uchunguzi kwa kutumia mfumo wa CRISPRI.b sgRNA uboreshaji baada ya uchunguzi.Mstari wa nukta mlalo unawakilisha logi2 (mabadiliko ya kukunjwa) = ±0.58.Mstari wa nukta wima unaonyesha thamani ya p = 0.05.Vitone vyeusi vinawakilisha sgRNA isiyolengwa (iliyoteuliwa kama NC).Nukta nyekundu ni sgRNA zinazolenga DARS-AS1.Nukta za samawati ni sgRNA zinazolenga LINC00205, lncRNA ya oncogenic iliyoelezwa hapo awali.fold change = (kusoma kwa kawaida, siku 17)/(kusoma kwa kawaida, siku 0).c DARS-AS1 sgRNA kuporomoka kumezuia ukuaji wa seli.Pau za hitilafu zinawakilisha ± mkengeuko wa kawaida wa majaribio matatu.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 Mtihani wa t wa Mwanafunzi wenye mikia miwili.d usemi wa DARS-AS1 katika uvimbe (seti ya data ya TCGA).em Usemi wa DARS-AS1 katika sampuli zilizooanishwa za kawaida na uvimbe kutoka kwa wagonjwa walio na BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, na COAD, mtawalia (seti ya data ya TCGA).thamani za p zilipatikana kwa kutumia mtihani wa t wa Mwanafunzi wenye mikia miwili.
Baada ya kuunda plasmid na kufunga lentivirus, tulipitisha laini ya seli ya saratani ya utumbo mpana ya dCas9-SW620 na maktaba iliyo hapo juu katika majaribio manne huru ya maambukizi.Wingi wa maambukizi (MOI) kwa maambukizi haya ulikuwa 0.1–0.3, ikionyesha kwamba kila seli inaweza tu kuambukizwa kwa sgRNA moja.Baada ya siku 18 za utamaduni wa ndani, wasifu wa uboreshaji wa sgRNA lengwa ulipungua au kuongezeka baada ya kuchunguzwa, wakati idadi ya oligonucleotides ya udhibiti isiyolengwa ilibakia bila kubadilika ikilinganishwa na wasifu wa uchunguzi wa awali, ikionyesha kuwa lengo letu lina skrini mahususi zaidi. maktaba.Mchele.1b na jedwali la nyongeza 1). LINC00205, ambayo hapo awali iliripotiwa kukuza saratani ya mapafu na maendeleo ya saratani ya ini58,59,60, ilichunguzwa (log2 (foldchange) <-0.58, p thamani <0.05), kuthibitisha kuegemea kwa uchunguzi huu (Mchoro 1b). LINC00205, ambayo hapo awali iliripotiwa kukuza saratani ya mapafu na maendeleo ya saratani ya ini58,59,60, ilichunguzwa (log2 (foldchange) <-0.58, p thamani <0.05), kuthibitisha kuegemea kwa uchunguzi huu (Mchoro 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, iliyoripotiwa hapo awali kukuza maendeleo ya saratani ya mapafu na saratani ya ini58,59,60, haikujumuishwa (logi2 (mabadiliko ya mara) <-0.58, p-value <0.05), kuthibitisha uimara wa uchunguzi huu (Mtini. .1b) . LINC00205 之前 被 报道 促进 肺癌 和 肝癌 肝癌 进展 58,59,60 ， 筛 筛 选 （（（倍数））） <-0.58 ， p 值 <0.05） ， 证实 该 该 的 可靠性 LINC00205 之前 被 报道 促进 肺癌 和 肝癌 肝癌 进展 58,59,60 ， 筛 筛 选 （（（倍数））） <-0.58 ， p 值 <0.05） ， 证实 该 该 的 可靠性 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, iliyoripotiwa hapo awali kukuza maendeleo ya saratani ya mapafu na ini58,59,60, haikujumuishwa (logi2 (mabadiliko ya mara) <-0.58, p-thamani <0.05), kuthibitisha uimara wa uchunguzi huu (Mchoro .1b).
Miongoni mwa lncRNAs wote kupimwa, DARS-AS1 pia kupimwa, na tatu cognate oligonucleotides sgRNA kwa kiasi kikubwa kupunguzwa baada ya siku 18 ya utamaduni, na kupendekeza kuwa knockdown ya lncRNA hii ilisababisha kupunguza kuenea kwa kansa (Mtini. 1b).Matokeo haya yaliungwa mkono zaidi na uchanganuzi wa MTS katika seli za saratani ya utumbo mpana unaoonyesha kuwa kasi ya ukuaji wa seli za DARS-AS1 ilikuwa nusu tu ikilinganishwa na seli za kudhibiti (Kielelezo 1c) na ilikuwa sawa na ripoti za hapo awali za aina zingine kadhaa za saratani.: saratani ya figo ya seli wazi, saratani ya tezi na saratani ya mapafu ya seli isiyo ndogo51,52,53,55.Walakini, kazi yake na mifumo ya molekuli katika saratani ya colorectal bado haijachunguzwa.Kwa hivyo, tulichagua lncRNA hii kwa utafiti zaidi.
Ili kujifunza usemi wa DARS-AS1 kwa wagonjwa, tulichanganua kwa kina sampuli 10,327 za uvimbe kutoka kwa mradi wa Cancer Genome Atlas (TCGA).Matokeo yetu yanaonyesha kuwa DARS-AS1 imeonyeshwa kwa wingi na kudhibitiwa kwa kiasi kikubwa katika seli zenye afya katika aina mbalimbali za uvimbe, ikiwa ni pamoja na colon adenocarcinoma (COAD), renal clear cell carcinoma (KIRC), na renal papilary cell carcinoma (KIRP)..Wachache sana (Kielelezo 1d na Kielelezo cha Nyongeza 1a, b). Uchambuzi wa sampuli zilizooanishwa zenye afya/uvimbe ulithibitisha zaidi usemi wa juu zaidi wa DARS-AS1 katika uvimbe wa saratani ya urothelial ya kibofu (BLCA), saratani ya seli ya figo ya figo (KIRC), adenocarcinoma ya kibofu (PRAD), saratani ya mapafu ya squamous cell (LUSC) , uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC), uvimbe adenocarcinoma (LUAD), ini hepatocellular carcinoma (LIHC), figo figo papilari cell carcinoma (KIRP), na colon adenocarcinoma (COAD) (p thamani <0.05) (Mtini. 1e-m) . Uchambuzi wa sampuli zilizooanishwa zenye afya/uvimbe ulithibitisha zaidi usemi wa juu zaidi wa DARS-AS1 katika uvimbe wa saratani ya urothelial ya kibofu (BLCA), saratani ya seli ya figo ya figo (KIRC), adenocarcinoma ya kibofu (PRAD), saratani ya mapafu ya squamous cell (LUSC) , uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC), uvimbe adenocarcinoma (LUAD), ini hepatocellular carcinoma (LIHC), figo figo papilari cell carcinoma (KIRP), na colon adenocarcinoma (COAD) (p thamani <0.05) (Mtini. 1e-m) .Uchambuzi wa sampuli zilizooanishwa za afya/uvimbe pia ulithibitisha usemi wa juu zaidi wa DARS-AS1 katika saratani ya urothelial ya kibofu (BLCA), saratani ya seli safi ya figo na seli ya figo (KIRC), adenocarcinoma ya kibofu (PRAD), uvimbe wa squamous cell carcinoma (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , saratani ya endometriamu ya corpus uteri (UCEC), adenocarcinoma ya mapafu (LUAD), hepatocellular carcinoma ya ini (LIHC), papilari cell carcinoma ya figo (KIRP), na adenocarcinoma ya koloni (COAD) (p thamani < 0.05) (Mchoro 1e- m) .配对 健康 健康 肿瘤样本显着 更 高 表达 子宫体子宫 子宫体子宫 内膜 癌 （（（（癌 癌 癌 癌 癌 癌 癌 癌 癌 癌 癌 癌 癌 癌<0.05（图1e-m) .配 对 健康/肿瘤样本 的 证实 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 尿路 尿路 尿路 上 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌(LUSC) 肿瘤 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中癌 (kirp) (coad) (p 值<0.05) (图1e-m) .Uchanganuzi wa sampuli zilizooanishwa za afya/uvimbe ulisaidia zaidi dhima ya DARS-AS1 katika saratani ya urothelial ya kibofu (BLCA), saratani ya seli ya figo ya wazi (KIRC), adenocarcinoma ya kibofu (PRAD), na uvimbe wa seli ya mapafu ya squamous (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). kujieleza katika corpus uterine carcinoma (UCEC), adenocarcinoma ya mapafu (LUAD), hepatocellular carcinoma (LIHC), renal papilari cell carcinoma (KIRP), na colon adenocarcinoma (COAD) (p thamani <0.05) (Mchoro 1e -m).Yakijumlishwa, matokeo haya yanaonyesha kuwa DARS-AS1 inaonyeshwa sana na inaonyeshwa sana katika aina mbalimbali za saratani.
Kwa sababu DARS-AS1 na DARS (jeni linalosimba uzi wa antisense) hushiriki promota sawa na ziko kando ya nyingine, tulibuni shRNA ili kuangusha DARS-AS1 mahususi lakini si DARS (Mchoro wa Ziada 2a,b na Jedwali la Ziada 2) .Kando na SW620, pia tulitumia mistari mingine mitatu ya seli inayoeleza sana DARS-AS1 ili kuchunguza ufanisi na utendakazi wa shRNA kuangusha (Jedwali la Ziada la 3).Matokeo yetu yalionyesha kuwa shRNA zote tatu zilizotengenezwa zilipata angalau ufanisi wa 80% wa DARS-AS1 na athari ndogo kwa kiasi cha DARS mRNA (Mchoro wa Nyongeza 2c–f).Kwa kuongezea, tuligundua kuwa kuporomoka kwa DARS-AS1 kwa shRNA hizi kulizuia kwa kiasi kikubwa ukuaji wa seli katika mistari ya seli ya saratani ya colorectal SW620 (49.7%) na HCT116 (27.7%), mstari wa seli ya saratani ya matiti MBA-MD-231 (53.4%).) na mstari wa seli ya hepatoma ya HepG2 (kupunguzwa kwa 92.7%), pamoja na uwezo wao wa kuunda nyanja zisizo na waya (kupunguza wastani wa ~ 50.8%, 44.6%, 40.7% na 75.7% kwa kila mstari wa seli) (Mchoro 2a, b).Katika SW620, matokeo ya majaribio ya uundaji wa koloni yalithibitisha zaidi kwamba DARS-AS1 shRNA ilizuia kwa kiasi kikubwa kuenea kwa seli na kupungua kwa wastani kwa takriban 69.6% (Mchoro 2c).
Madhara ya udhibiti wa shRNA na DARS-AS1 shRNA kwenye kuenea kwa seli (a) na uundaji wa spheroid (b) katika SW620, HCT116, MBA-MD-231, na seli za HepG2.c Athari ya udhibiti wa shRNA na DARS-AS1 shRNA kwenye uundaji wa koloni katika seli za SW620.Kuenea kwa seli (d), uundaji wa spheroid (e), na uundaji wa koloni (f) ya seli za SW620 zinazodhihirisha kupita kiasi DARS-AS1.Data iliyoonyeshwa ni wastani wa ± mkengeuko wa kawaida wa majaribio matatu.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, na *** p ≤ 0.001 kwa mtihani wa t wa Mwanafunzi wenye mikia miwili.
Ili kukamilisha tafiti za upotevu wa utendakazi, tulianzisha baadaye seli za SW620 zinazoonyesha DARS-AS1 (Mchoro wa Nyongeza 2g).Kujieleza kupita kiasi kwa DARS-AS1 kwa kiasi kikubwa kuliongeza ukuaji wa seli (mara 1.8), uundaji wa spheroid usio na nanga (mara 1.4), na uundaji wa koloni (mara 3.3) katika seli za SW620 (Mchoro 2d-f).Tulithibitisha tokeo hili kwa kutumia laini nyingine ya DARS-AS1 inayoonyesha, A549.Uenezi huu wa seli ulioimarishwa kwa sababu ya kujieleza kupita kiasi kwa DARS-AS1 ulionekana zaidi katika seli za A549 (Mchoro wa Nyongeza wa 2h, i na Jedwali la Ziada la 3).Kwa pamoja, tafiti hizi za faida na hasara zinaonyesha kuwa DARS-AS1 inakuza kuenea kwa seli za saratani katika vitro.
Ili kuchunguza mbinu msingi ambayo DARS-AS1 inadhibiti kuenea kwa seli, tulifanya uchanganuzi wa kuvuta chini wa RNA ili kutambua washirika wake wanaoweza kumfunga protini.Matokeo ya RT-qPCR yalionyesha kuwa karibu 86.2% ya DARS-AS1 iko kwenye saitoplazimu ya seli za SW620 (Mchoro wa Nyongeza 3a).In vitro iliyonakiliwa kwa biotinylated DARS-AS1 au pseudoRNA iliwekwa kwenye seli za seli za SW620 na kufuatiwa na utengano wa SDS-PAGE.Madoa ya fedha yaliyofuata yalionyesha kuwa bendi tofauti (~38 kDa) iliimarishwa kwa kiasi kikubwa katika sampuli za kuvuta za DARS-AS1 lakini si katika sampuli za dummy za RNA au shanga (Kielelezo 3a).Bendi hii ilitambuliwa kama protini inayowasha PKR (PACT) kwa spectrometry (MS) na kuthibitishwa zaidi na kuzuia kinga katika SW620, HCT116, na mistari ya seli ya HepG2 (Mchoro 3a, b).Uboreshaji wa DARS na protini zinazohusiana za PACT - PKR na TRBP - pia zilichunguzwa kwa kutumia uchanganuzi wa RNA na Western blotting (WB).Matokeo yalionyesha kuwa hakuna mwingiliano wa moja kwa moja kati ya DARS-AS1 RNA na protini hizi tatu ulipatikana (Mchoro wa ziada wa 3b).Mwingiliano mahususi kati ya DARS-AS1 na PACT ulithibitishwa zaidi na uchanganuzi wa RNA immunoprecipitation (RIP), ambao ulionyesha kuwa DARS-AS1 ilirutubishwa kwa kiasi kikubwa katika kingamwili za kupambana na PACT lakini si RNA nyingine za udhibiti (Mchoro 3c).Ili kubaini ikiwa DARS-AS1 inaingiliana moja kwa moja na PACT bila vijenzi vingine vyovyote vya seli, uchunguzi wa in vitro biolayer interferometry (BLI) ulifanyika kwa kutumia PACT iliyosafishwa.Biotin-yenye lebo ya DARS-AS1 au dummy RNA haikusogezwa kwenye vihisi vya streptavidin (SA) na kisha kuingizwa kwenye bafa ya kinetic iliyo na 1 μM PACT.Hasa, PACT inafungamana sana na DARS-AS1 (thamani ya KD ~26.9 nM), lakini si kuiga RNA (Mchoro 3d).Yakijumuishwa, matokeo haya yanaonyesha mwingiliano wa moja kwa moja na mshikamano wa juu kati ya DARS-AS1 na PACT.
Uchanganuzi wa uvutaji wa RNA ulibaini DARS-AS1 inayoingiliana na PACT katika seli za SW620.Hapo juu, uchafu wa fedha wa protini zinazohusiana.Vizuia kinga vya chini vilifanywa na anti-PACT antibody.Uchunguzi wa b RNA wa kuvuta-chini ulifanywa katika seli za HCT116 (juu) na HepG2 (chini).Uboreshaji wa PACT uligunduliwa kwa kuzuia kinga.Uchambuzi wa cRNA immunoprecipitation (RIP) ulifanyika katika seli za SW620 kwa kutumia kingamwili zilizoonyeshwa.d PACT zinazofunga curve kwa urefu kamili wa DARS-AS1 au udhibiti wa RNA zilipatikana kwa kutumia biolayer interferometry (BLI).RNA ilikuwa imezimwa kwenye biosensor ya streptavidin.1 μM PACT ilitumika kupima muungano.e RNA kuvuta assay ilifanywa kwa kutumia biotinylated full-length DARS-AS1 au truncated (juu).Immunoblot inayoonyesha PACT iliyopokelewa (chini).f PACT iliyoalamishwa iliyosafishwa iliwekwa ndani kwa urefu kamili wa biotini DARS-AS1 au kupunguzwa (kama ilivyo katika e) kwa jaribio la RIP la in vitro.RNA iliyotolewa ilithibitishwa na RT-qPCR.g Uhusiano wa jamaa wa vipande tofauti vya RNA kwa PACT ulipatikana kwa kutumia interferometry ya biolayer.Kwa uchambuzi, 100 nM RNA na 1 μM RAST zilitumika.h Majaribio ya RIP ya In vitro yalifanywa kwa kutumia pureified intact au kukatwa kwa lebo ya PACT.RNA iliyotolewa ilithibitishwa na RT-qPCR.i Kiwango cha ukuaji wa seli za SW620 zinazozidisha DARS-AS1, PACT, au zote mbili.j Udhihirisho kupita kiasi wa urefu kamili au uliopunguzwa wa DARS-AS1 katika seli za SW620 ulikuwa na athari tofauti kwenye ukuaji wa seli.k Apoptosis iligunduliwa kwa kuzuia kinga mwilini kwa kutumia kingamwili ya anti-PARP.l Kushindwa kwa DARS-AS1 huleta apoptosis ya seli za SW620 kama inavyoonyeshwa na saitoometri ya mtiririko.Data iliyoonyeshwa ni wastani wa ± mkengeuko wa kawaida wa majaribio matatu. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, kwa mtihani wa t wa Mwanafunzi wenye mikia miwili. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, kwa mtihani wa t wa Mwanafunzi wenye mikia miwili. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001 kwa mtihani wa t wa Mwanafunzi wenye mikia miwili. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001 kwa mtihani wa t wa Mwanafunzi wenye mikia miwili.
Kisha tulitengeneza vipande vitatu vya DARS-AS1 RNA vya biotini kwa unukuzi wa in vitro ili kutambua eneo la DARS-AS1 linalohitajika kwa uhusiano wa PACT (Mchoro 3e).Matokeo ya uchambuzi wa RNA yalionyesha kuwa kila kipande kiliweza kuingiliana na PACT, lakini eneo la 3'-terminal (384-768 nucleotides iliyoitwa A3) ilionyesha zaidi ya 1-384 nucleotides iliyoitwa A1) (Mchoro 3e).Matokeo sawa yalizingatiwa katika jaribio la in vitro RIP kwa kutumia recombinant PACT (Kielelezo 3f).Sambamba na matokeo haya, majaribio ya kuunganisha vipande vya RNA visivyohamishika kwa PACT kwa kutumia BLI pia yalionyesha kuwa PACT ina uhusiano wa juu zaidi wa A3 (384–768 nt) (thamani ya KD ya takriban 94.6 nM), huku karibu hakuna viungo na maeneo mengine.(Mchoro 3d).
Pia tulichunguza maeneo yanayohusika katika PACT.PACT ina vikoa vitatu vinavyofanya kazi, viwili kati yake ni vikoa vya kuunganisha RNA vyenye nyuzi mbili (dsRBD) na kikoa cha tatu (kilichoteuliwa D3) ambacho hufanya kazi kama kiwezeshaji cha mwingiliano wa protini.Ili kuchunguza uwezo wa kumfunga lncRNA wa kila kikoa, tulitengeneza mabadiliko matatu ambayo yaliondoa kila moja ya vikoa vitatu na kufanya jaribio la RIP la in vitro.Matokeo yetu yalionyesha kuwa kufutwa kwa kikoa cha tatu (D3) cha PACT kilipunguza kwa kiasi kikubwa mwingiliano wake na DARS-AS1 (kwa mara 0.11 ikilinganishwa na PACT isiyobadilika) ikilinganishwa na mabadiliko mengine mawili (Mtini. 3h), ilionyeshwa kuwa kutolewa. ya D3 iliingiliana na DARS.-AC1.Yakijumuishwa, matokeo haya yanapendekeza kwamba mwingiliano kati ya DARS-AS1 na PACT unaweza kutokea hasa kupitia mwisho wa 3′ wa DARS-AS1 na kikoa cha D3 cha PACT.
Tulibaini kuwa DARS-AS1 haikuwa na athari kwa usemi wa PACT na PACT haikuwa na athari kwa DARS-AS1 (Mchoro wa Nyongeza 3c).Kisha tukachunguza athari za PACT kwenye ukuaji wa seli.Tofauti na DARS-AS1, seli jamaa zilikua mara 1.5-3 kwa kasi wakati PACT ilipoangushwa (Mchoro wa Nyongeza 3d).Matokeo ya uchunguzi wa malezi ya koloni yalionyesha kuwa seli ziliunda makoloni mara 2-3 baada ya matibabu ya shRNA na PACT (Mchoro wa ziada wa 3e).Ili kupima kama DARS-AS1 inadhibiti uenezaji wa seli kupitia PACT, tulitengeneza seli za SW620 zinazoonyesha kuzidisha PACT, DARS-AS1, au zote mbili.Overexpression ya PACT ilionyesha kizuizi kikubwa cha kuenea kwa seli (Kielelezo 3i).Ingawa usemi kupita kiasi wa DARS-AS1 kwa kila seti ulikuza sana kuenea kwa seli, hakukuwa na tofauti kubwa katika kasi ya ukuaji wa seli zinazoonyesha DARS-AS1 na PACT kupita kiasi.Matokeo haya yanapendekeza kuwa PACT inaweza kukabiliana na ongezeko la kuenea linalosababishwa na kujieleza kupita kiasi kwa DARS-AS1.
Kwa kuwa maeneo tofauti ya DARS-AS1 yana uwezo tofauti wa kumfunga PACT, tulichunguza ushawishi wao wa kiasi katika ueneaji wa seli kwa udhihirisho tofauti wa kupita kiasi wa vipande vya DARS-AS1.Ikilinganishwa na vipande vingine viwili, DARS-AS1 ilionyeshwa sana katika mwisho wa 3 (384-768 nt), eneo kuu linalohusiana na PACT katika DARS-AS1, ambalo lilikuwa na uwezo wa juu zaidi wa kuchochea kuenea kwa seli (Mchoro 3j).Matokeo haya yanaonyesha uwiano mzuri kati ya uwezo wa kuunganisha na utendakazi wa kibayolojia wa DARS-AS1.
PACT imeripotiwa kuwa pro-apoptotic protini19.Kwa hivyo, tulichunguza athari za DARS-AS1 kwenye apoptosis.Kama ilivyotarajiwa, kuporomoka kwa DARS-AS1 kuliongeza kwa kiasi kikubwa kupasuka kwa PARP katika seli za SW620 na kuongeza idadi ya seli chanya za annexin V katika SW620, HCT116, HepG2, na MBA-MD-231 mistari ya seli (Mchoro 3k).3).3f–h), ikionyesha kuwa athari ya DARS-AS1 katika seli za saratani ni kinyume na utendaji wa apoptosisi ya PACT.Yakijumlishwa, matokeo haya yanapendekeza kuwa utaratibu wa utendakazi wa DARS-AS1 unaweza kuwa kupitia kuzuiwa kwa utendaji kazi wa PACT.
Kisha, tulichunguza athari za kiutendaji za chama cha DARS-AS1-PACT.PACT imeripotiwa kuwezesha PKR kupitia mwingiliano wa moja kwa moja, ambao baadaye huongeza phosphorylation ya eIF2α, na kusababisha ufutaji wa utafsiri na apoptosis17.Kwanza, tulichunguza ikiwa DARS-AS1 huathiri ujanibishaji wa seli za PACT na PKR.Hadubini ya ushawishi wa fluorescence ilionyesha kuwa PACT na PKR ziliunganishwa sana katika seli za SW620 na wastani wa mgawo wa uwiano wa Pearson wa 0.72.Wakati huo huo, ujielezaji kupita kiasi wa DARS-AS1 ulipunguza kwa kiasi kikubwa ujanibishaji mwenza wa PACT na PKR (maana ya mgawo wa uwiano wa Pearson 0.61) (Mchoro 4a).Ili kuchunguza ikiwa DARS-AS1 inaweza kurekebisha mwingiliano wa PACT-PKR, tulifanya jaribio la kutoa kinga-mwili (co-IP) kwa kutumia kingamwili ya anti-PACT katika lisati za seli za SW620.PKR ilirutubishwa sana katika kupambana na PACT katika seli za udhibiti, wakati urejeshaji wa PKR ulipunguzwa kwa kiasi kikubwa katika lysates kutoka kwa seli zinazozidisha DARS-AS1 (Mchoro 4b).Iliyosafishwa yenye lebo ya PACT na PKR ilitumika kwa majaribio ya kufunga protini katika vitro.Ipasavyo, zile zilizotoa DARS-AS1 lakini hakuna udhibiti wa RNA zilionyesha mwingiliano uliokandamizwa wa PACT-PKR (Mchoro 4c).Matokeo yote yalionyesha kuwa DARS-AS1 ilitatiza mawasiliano ya PACT na PKR.
Ujanibishaji Mshirikishi wa PACT na PKR katika seli za udhibiti au seli zinazodhihirisha kupita kiasi DARS-AS1 ulionekana kwa kutumia hadubini ya florascence ya confocal.Viini vilitiwa doa na DAPI.Matokeo ya takwimu yalipatikana kutoka kwa picha 16.b Co-immunoprecipitation (co-IP) kwa kutumia anti-PACT antibody katika seli za seli za udhibiti wa seli za SW620 au seli zinazozidisha DARS-AS1.c Iliyowekwa alama ya PACT, PKR iliyosafishwa na kunukuliwa kwa njia ya ndani kwa kutumia DARS-AS1 au RNA ya dhihaka ziliwekwa ndani kwa ajili ya uchanganuzi wa kuunganisha protini katika vitro.Kingamwili za kuzuia bendera zilitumika kwa kuzuia kinga.d Immunoblots zilizo na kingamwili zilizoonyeshwa zilifanywa katika seli za SW620 na HCT116 zilizopitishwa kwa udhibiti wa shRNA au DARS-AS1-shRNA ikifuatiwa na njaa ya serum.Viwango vya kujieleza vya DARS-AS1 vilibadilisha unyeti wa seli kwa thapsigargin.Seli za SW620 zilipitishwa kwa DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 plasmid ya kujieleza kupita kiasi au plasmid ya kudhibiti.Seli zilitibiwa na thapsigargin kwa saa 48 na uwezo wa chembe hai ulibainishwa kwa kutumia kitendanishi cha MTS.f In vitro iliyonukuliwa DARS-AS1 au dummy RNA na purified PACT zilitumika kwa majaribio ya kuwezesha in vitro na kugundua kinga za mwili.g Immunoblots kwa kutumia kingamwili hizi zilitekelezwa kwenye seli za SW620-ctrl (kushoto) au seli zinazoonyesha mabadiliko makubwa ya PKR (kulia).Seli hizi zilipitishwa kwa udhibiti shRNA au DARS-AS1-shRNA ikifuatiwa na njaa ya seramu.h Saitometi ya mtiririko ilionyesha kuwa kuzima kwa PKR inayobadilika kulifidia apoptosis inayotokana na DARS-AS1 katika seli za SW620.i Immunoblots zilizo na kingamwili zilizoonyeshwa zilifanywa katika seli za SW620 (kushoto) au HCT116 (kulia).Seli zilizoambukizwa kwa kidhibiti shRNA au DARS-AS1 shRNA hazina seramu na kuongezwa kizuizi cha 100 nM PKR C16 au DMSO.Upau wa mizani = 5 µm.Data iliyoonyeshwa ni wastani wa ± mkengeuko wa kawaida wa majaribio matatu.* p ≤ 0.05 Mtihani wa t wa Mwanafunzi wenye mikia miwili.
Kwa ujumla inaaminika kuwa mara PACT inapoingiliana na PKR17, fosforasi ya PKR katika Thr451 inaweza kushawishiwa.Matokeo yetu yalionyesha kuwa kiwango cha phosphorylation ya PKR kiliinuliwa kwa kiasi kikubwa katika seli za DARS-AS1 baada ya njaa ya serum (Mchoro 4d na Supplementary Fig. 4a).Ipasavyo, tuligundua kwamba phosphorylation ya eIF2α, substrate kuu ya PKR, pia iliongezeka kwa kiasi kikubwa na DARS-AS1 shRNA (Mchoro 4d na Supplementary Fig. 4a).Thapsigargin ni mkazo wa ER unaosababisha ER kutoa Ca2+.Matibabu na thapsigargin imeripotiwa kushawishi usemi na uanzishaji wa PACT, ambayo inaingiliana zaidi na kuamsha PKR, na kusababisha apoptosis kwa kuongeza eIF2α phosphorylation 18,61.Hapa, tulitumia thapsigargin kama kichocheo cha njia ya PACT/PKR ili kuchunguza kama DARS-AS1 inaweza kusaidia seli kushinda mfadhaiko kwa kuzuia njia ya PACT/PKR.Tuliona kuwa kiwango cha usemi wa DARS-AS1 kilihusiana vyema na ukinzani wa seli kwa thapsigargin.Seli za SW620 zinazodhihirisha kupita kiasi DARS-AS1 zilinusurika vyema zaidi zilipotibiwa na thapsigargin, huku seli zilizo na DARS-AS1 zikiathiriwa zaidi (Mchoro 4e).Sambamba na matokeo haya, DARS-AS1 overexpression ilipunguza phosphorylation ya PKR iliyosababishwa na thapsigargin (Mchoro wa ziada wa 4b).Kwa kulinganisha, baada ya matibabu ya thapsigargin, PKR na eIF2α walikuwa phosphorylated kwa kiwango cha juu katika seli DARS-AS1 knockdown ikilinganishwa na seli kudhibiti (Supplementary Mtini. 4b).Jambo la kushangaza, thapsigargin ilianzisha usemi wa DARS-AS1 kwa njia inayotegemea kipimo, ambayo inaweza kuonyesha utendaji kazi wa kupambana na mfadhaiko wa DARS-AS1 (Mchoro wa Nyongeza 4c).Kwa kuongezea, tulifanya majaribio ya kuwezesha katika vitro ili kuthibitisha uchunguzi huu.Kwa ufupi, PKR ilisafishwa kutokana na lisati za seli kwa kutumia kingamwili ya kupambana na PKR, kisha kuingizwa kwenye recombinant PACT na DARS-AS1 iliyonakiliwa kwa njia ya asili.Baada ya mmenyuko wa enzymatic, phospho-PKR iligunduliwa kwa kutumia WB.Matokeo yetu yalionyesha kuwa phosphorylation ya PKR ilizuiwa kwa kiasi kikubwa na DARS-AS1, lakini si kwa udhibiti wa RNA (Mchoro 4f).Matokeo haya ya in vitro na vivo yanapendekeza kuwa DARS-AS1 inhibitisha uwezeshaji wa PACT-mediated PKR.Wakati huo huo, tuliona pia kupungua kwa kupona kwa PACT mbele ya DARS-AS1 (Mchoro 4f).Matokeo haya yanawiana na matokeo ya jaribio la kufunga protini katika vitro (Mchoro 4c) na linaonyesha tena kazi ya kuzuia ya DARS-AS1 kwa uhusiano wa PACT-PKR.
Ser246 na Ser287 katika kikoa cha D3 cha PACT zinahitajika ili kuwezesha PKR chini ya mkazo wa seli.Uingizwaji wa mabaki mawili ya serine badala ya alanini ulitoa PACT (mutD) inayobadilika, ambayo iliwasha PKR bila mkazo, na uingizwaji wa alanine (mutA) ulibadilisha itifaki.Kwa kuwa tumeonyesha umuhimu wa kikoa hiki kwa uhusiano wa moja kwa moja na DARS-AS1, tulitengeneza vibadilikaji hivi viwili vya PACT ili kupima kama mabaki haya yanaweza pia kuhusika katika mwingiliano na DARS-AS1.Jambo la kufurahisha ni kwamba, vibadilika-badilika vyote viwili vilipoteza uwezo wa kujifunga kwa DARS-AS1 (Mchoro wa Nyongeza wa 4d), ikipendekeza kwamba muundo kamili wa protini ya PACT unaweza kuhitajika kwa mwingiliano mzuri na DARS-AS1.
Zaidi ya hayo, matokeo yetu pia yanapendekeza kuwa kizuizi cha DARS-AS1-shRNA-kichochezi cha kuenea kwa seli kinaweza kurejeshwa kwa kudhihirisha kupita kiasi kibadilishaji hasi cha PACT (PACTmutA) au kibadilishaji hasi cha PKR (PKRmut) (Mchoro wa Nyongeza. 4e. e).Udhihirisho wa kupita kiasi wa mabadiliko hasi ya PKR ulipunguza fosforasi ya PKR iliyochochewa na kuporomoka kwa DARS-AS1 pamoja na phosphorylation ya eIF2α katika seli zisizo na seramu (Mchoro 4g).Muhimu zaidi, uwiano wa seli za apoptotic zilizochochewa na kuporomoka kwa DARS-AS1 pia ulipunguzwa katika seli zinazoonyesha PKRmut kupita kiasi (Mchoro 4h na Kielelezo cha 4g cha Nyongeza).Uzuiaji wa shughuli za PKR kinase pia hudhoofisha utendakazi wa DARS-AS1, kwa kuwa matokeo yalionyesha kuwa kuporomoka kwa DARS-AS1 hakukuwa na uwezo wa kuibua fosforasi ya PKR na eIF2α wakati seli zilitibiwa kwa kizuizi mahususi cha PKR C16 (Mchoro 4i na Kielelezo cha 4 cha Nyongeza).)Yakijumlishwa, matokeo yetu yanapendekeza kuwa DARS-AS1 inakuza kuenea kwa seli, angalau kwa kiasi, kwa kuzuia uwezeshaji wa PKR inayopatanishwa na PACT.
Ili kuchunguza zaidi jukumu la DARS-AS1 katika tumorigenesis, tulifanya majaribio ya kusisimua kwa kutumia mfano wa xenograft ya panya. Matokeo yanaonyesha kuwa kuporomoka kwa DARS-AS1 kulipunguza ukuaji wa uvimbe kwenye panya (thamani ya p <0.0001) (Mchoro 5a). Matokeo yanaonyesha kuwa kuporomoka kwa DARS-AS1 kulipunguza ukuaji wa uvimbe kwenye panya (thamani ya p <0.0001) (Mchoro 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (kifungu 5а). Matokeo yanaonyesha kuwa kuporomoka kwa DARS-AS1 hupunguza kwa kiasi kikubwa ukuaji wa uvimbe katika panya (thamani ya p <0.0001) (Mchoro 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）.结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a). Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис. 5а). Matokeo yalionyesha kuwa kuporomoka kwa DARS-AS1 kulipunguza kwa kiasi kikubwa ukuaji wa uvimbe katika panya (thamani ya p <0.0001) (Mchoro 5a).Kwa hivyo, katika kikundi cha DARS-AS1, kulikuwa na upungufu mkubwa wa kiasi cha tumor wastani kwa karibu 72.9% na wastani wa wingi wa tumor kwa karibu 87.8% (Mchoro 5b-d).Matokeo haya yanapendekeza sana kwamba DARS-AS1 inaweza kukuza ukuaji wa uvimbe katika vivo.
Madhara ya tangazo la DARS-AS1 kwenye oncogenesis ya colorectal katika panya uchi.Mikondo ya ukuaji (a), saizi ya uvimbe (b), uzito (c), na picha za uvimbe (d) zinaonyeshwa.Pau za hitilafu zinawakilisha ±SEM. n = 10. ****p <0.0001, kwa mtihani wa Mwanafunzi wenye mikia miwili. n = 10. ****p <0.0001, kwa mtihani wa Mwanafunzi wenye mikia miwili. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p <0.0001 Mtihani wa t wa Mwanafunzi wenye mikia miwili.n = 10. ****p <0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p <0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 Mtihani wa t wa Mwanafunzi wenye mikia miwili.e Kaplan-Meier alichanganua uwiano kati ya viwango vya kujieleza vya DARS-AS1 na maisha ya jumla kwa wagonjwa walio na UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, na LGG.Viwango vya juu vya kujieleza kwa DARS-AS1 kwa wagonjwa walikuwa katika 50% ya juu;kiwango cha chini cha kujieleza kwa DARS-AS1 kwa wagonjwa kilikuwa chini ya 50%.maadili ya p yaliamuliwa kwa kutumia jaribio la kiwango cha logi.f Muundo unaopendekezwa ambapo DARS-AS1 inadhibiti njia ya PACT-PKR na ukuaji wa uvimbe.
Ili kuelewa vyema athari za kimatibabu za DARS-AS1, tulichunguza uwiano kati ya kujieleza kwake na kuendelea kwa mgonjwa.Kwa kuchanganua mkusanyiko wa data wa TCGA, tuligundua kuwa usemi wa juu wa DARS-AS1 ulihusishwa na uveal melanoma (UVM), kromofobia ya figo (KICH), saratani ya seli ya papilari ya figo (KIRP), mesothelioma (MESO), multiplex.Uhai wa chini ulihusishwa kwa kiasi kikubwa na morphosis ya glioblastoma (GBM) na wagonjwa wenye glioma ya ubongo ya chini (LGG) (Mchoro 5e).Matokeo haya yanapendekeza kuwa DARS-AS1 inaweza kuwa na jukumu muhimu katika ukuaji wa uvimbe wa kimatibabu na inaweza kuwa kiashirio kinachoweza kutabiriwa katika saratani nyingi.
Katika utafiti huu, kwa kutumia uchunguzi wa kazi wa CRISPRi kwa kiwango kikubwa, tuliamua kuwa DARS-AS1 lncRNA inashinda mkazo wa seli za saratani kwa kudhibiti vijibu viwili muhimu vya mfadhaiko, PACT na PKR.Kwa kuingiliana moja kwa moja na PACT, DARS-AS1 ilizuia uanzishaji wa PACT-mediated PKR, na hivyo kuzuia kifo cha seli za apoptotic na kukuza kuenea kwa seli (Mchoro 5f).Udhibiti wa DARS-AS1 umezingatiwa katika aina nyingi za saratani, na kupendekeza kwamba kazi yake ya kukuza maisha ya seli za saratani chini ya hali ya mkazo inaweza kutumika kwa aina nyingi za saratani.
PACT imetambuliwa kama protini ya kuwezesha PKR, na uwezeshaji wa PKR unaopatanishwa na PACT una jukumu muhimu katika majibu ya mfadhaiko kwa kudhibiti unukuzi, tafsiri, apoptosis na michakato mingine muhimu ya seli62.Kwa miongo kadhaa, majaribio yamefanywa kuelewa udhibiti mahususi wa saratani wa mpororo wa PACT-PKR.Hapa, utafiti wetu ulifunua utaratibu tofauti wa udhibiti wa PACT-PKR katika seli za saratani kupitia lncRNA DARS-AS1 ya seli, ambayo hufunga moja kwa moja kwa PACT, huzuia mwingiliano wa PACT-PKR, huzuia uanzishaji wa PKR na phosphorylation ya eIF2α, na hivyo kuzuia apoptosis inayosababishwa na mkazo na kuchochea ukuaji wa saratani hatimaye.seli.Ugunduzi huu unatoa mwanga juu ya malengo ya lncRNA ya ubashiri na matibabu ya saratani.
Data yetu ilionyesha kuwa kuporomoka kwa DARS-AS1 huhamasisha seli kwa njaa ya seramu kwa ongezeko kubwa la PKR ya fosforasi na eIF2α.Matokeo haya yanapendekeza kuwa DARS-AS1 inakuza maisha ya seli za saratani chini ya hali mbaya kwa kuzuia shughuli za PACT/PKR.RNA zingine kadhaa zisizo na usimbaji, kama vile ASPACT na nc886, pia zinahusika katika mhimili wa PACT/PKR kwa kupunguza PACT48 mRNA au kudhibiti ufosfori kiotomatiki kwa kushurutisha PKR49,50,64.Miongoni mwao, DARS-AS1 hufanya kama mtatizaji wa chama cha PACT-PKR.Utafiti huu unaboresha uelewa wetu wa udhibiti wa mhimili wa PACT/PKR na jukumu la lncRNAs katika majibu ya mafadhaiko.
PACT ina vikoa vitatu tofauti.Kila moja ya dsRBD mbili za kwanza inatosha kufikia ufungamanifu wa juu wa PACT kwa PKR, wakati kikoa cha tatu (D3) inahitajika kwa ajili ya kuwezesha PKR katika vitro na katika vivo.Utafiti wetu ulionyesha kuwa DARS-AS1 inaingiliana kwa upendeleo na kikoa cha D3 (Mchoro 3h).Kwa kuzingatia ukubwa mkubwa wa lncRNA (nyukleotidi 768), kumfunga DARS-AS1 kwa D3 kunaweza kuzuia mwingiliano kati ya kikoa cha PACT cha dsRBD na PKR, na hivyo kuzuia uhusiano wa PACT na PKR.Mabadiliko ya pointi za PACT ambayo yalichukua nafasi ya Ser246 na Ser287 katika D3 na alanine au aspartate yalivuruga uhusiano wake wa kisheria kwa DARS-AS1, ikiashiria umuhimu wa sifa za jumla za miundo na umeme za D3 katika uhusiano wao.Maelezo zaidi ya utaratibu huu yatahitajika katika siku zijazo, kwa kutumia uchambuzi sahihi zaidi wa biokemia na uchanganuzi wa juu wa muundo wa PACT.
Uchunguzi wa awali umeripoti kuwa DARS-AS1 inakuza kuenea kwa seli kupitia taratibu kadhaa51,52,53.Katika mfano mmoja, wachunguzi waliona kuwa DARS-AS1 ilidhibiti jeni yake ya antisense ya DARS ya kusimba protini kwa kulenga miP-194-5p katika seli za saratani ya figo.Walakini, katika utafiti huu, kuporomoka kwa DARS-AS1 kulikuwa na athari ndogo kwa unukuzi wa DARS katika aina nyingi za saratani, ikijumuisha angalau saratani ya colorectal, matiti na ini.Kwa sababu lncRNA huonyesha mifumo ya usemi wa seli na tishu mahususi, mbinu za utendaji haziwezi kuhifadhiwa katika aina zote za saratani, ambayo inaweza kuchangia tofauti hii kati ya uchunguzi wetu na tathmini za awali za saratani tofauti.Masomo maalum yanahitajika ili kufafanua taratibu maalum za michakato mbalimbali ya kisaikolojia na pathological.
Uchanganuzi wa data ya kimatibabu ulionyesha kuwa usemi wa DARS-AS1 katika uvimbe unahusiana kinyume na maisha ya wagonjwa wa saratani, ambayo inasisitiza umuhimu wa mhimili wa DARS-AS1/PACT/PKR katika ubashiri wa saratani.Kwa kumalizia, utafiti wetu unaonyesha kuwa DARS-AS1 ni mdhibiti wa mhimili wa kuashiria PACT/PKR, inakuza kuenea kwa seli za saratani, na inazuia apoptosis wakati wa majibu ya mafadhaiko, ambayo hutoa safu nyingine ya utafiti na ni ya kupendeza kwa utafiti wa siku zijazo juu ya matibabu yanayowezekana. .
Laini za seli za binadamu SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 na HEK293T zilipatikana kutoka kwa Miundombinu ya Kitaifa ya Rasilimali ya Njia ya Seli nchini Uchina.Seli zote zilidumishwa katika DMEM medium (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) zikisaidiwa na 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) na 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) katika 37°C, 5% CO2.incubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Kipinga Bendera, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (fosforasi S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosforasi S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulin, CST (2128);panya ya kawaida IgG, CST (5415S);sungura ya kawaida IgG, CST (2729S).Kingamwili zilipunguzwa 1:1000 katika PBST kwa uzuiaji wa Magharibi na 1:100 kwa IP.
sgRNAs zilitengenezwa kwa kutumia zana inayopatikana kwa umma inayoitwa CRISPR-ERA66.Tulitumia vigezo vya zana chaguomsingi kwa ukuzaji wa sgRNA na tovuti za kuunganisha za sgRNA zilizokokotwa katika eneo la kb 3.ilijikita katika TSS.Madimbwi ya oligonucleotides ya sgRNA yaliunganishwa katika CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) na kuunganishwa katika plasmidi za pgRNA zilizofanywa na binadamu (Addgene #44248).Jumla ya 12 µg za plasmid ya pgRNA iliyounganishwa ya kibinadamu, 7.2 µg ya psPAX2 (Addgene #12260), na 4.8 µg ya pMD2.G (Addgene #12259) ilipitishwa kwa pamoja hadi kwenye 5 x 106 HEK206 HEK293T Transfection DNA katika Reactionshes 1 cm. seli ( CWBIO, Beijing, Uchina) kwa kufuata maagizo ya mtengenezaji.Wadudu wenye virusi walikusanywa saa 48 na 72 baada ya kuambukizwa na kuchujwa kupitia kichungi cha 0.45 µm.Kwa uchunguzi, seli za SW620 zinazoonyesha protini ya mchanganyiko wa dCas9/KRAB zilipatikana kwa uhamisho wa virusi.Seli za SW620 zilizorekebishwa ziliambukizwa na maktaba ya virusi katika majaribio manne huru ya maambukizi katika MOI ya 0.1-0.3 na zilitolewa sampuli za puromycin 2 μg/ml (Sigma, St. Louis, MO) kwa siku 2.Baadaye, seli zilikuzwa kwa muda wa siku 18 kwa kutumia maktaba kwa kiwango cha chini cha seli 500/sgRNA kwa uchunguzi.
DNA ya Genomic ilitolewa kulingana na maagizo ya Kifurushi cha Midi ya Damu ya QIAamp (QIAGEN, Düsseldorf, Ujerumani; 51183).Kwa jumla, 100 μg ya DNA ya jeni kwa kila marudio ya kibaolojia ilitumika kujenga maktaba.Eneo la sgRNA lilikuzwa na raundi mbili za PCR na kuunganishwa kwa msimbopau.
Bidhaa za PCR zilisafishwa kwa kutumia jeli ya NucleoSpin® na vifaa vya utakaso vya PCR (MACHHEREY-NAGEL, Düren, Ujerumani; 740609.250) na kukaguliwa kwa kutumia kifaa cha kugundua DNA chenye nyuzi mbili za Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Upimaji wa MTS ulitumika kupima kuenea kwa seli.Seli zilipandwa kwenye sahani zenye visima 96 kwa msongamano wa awali wa seli 2000 kwa kisima.Idadi ya jamaa ya seli ilipimwa kila siku kwa muda ulioonyeshwa kwa jumla ya siku 4-6.Kwa kila kisima, 20 μl ya kitendanishi cha MTS (Promega) kilipunguzwa na 100 μl ya DMEM, kuingizwa na seli kwa saa 4 saa 37 ° C, na kisha OD490 ilipimwa.
Uwezo wa ukuaji usio na nanga uligunduliwa kwa kuchambua uundaji wa nyanja.Kwa ufupi, seli 2000 zilizoambukizwa kwa shRNA DARS-AS1 au udhibiti shRNA zilikuzwa katika vibamba vidogo vya chini zaidi (Corning) na mabadiliko ya wastani kila baada ya siku 4.Spheroids zilihesabiwa baada ya siku 14.Seli 500 zilizopitishwa kwa plasmid ya kujieleza kupita kiasi ya DARS-AS1 au plasmid ya kudhibiti zilitumika kwa ajili ya kupima uboreshaji, vinginevyo mbinu haikubadilishwa.
RNA ilinakiliwa kwa kutumia T7 RNA polymerase na biotin-16-UTP (Roche 1138908910) kulingana na maagizo ya Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Vitambulisho vinavyotumika hapa vimeorodheshwa katika Jedwali la 4 la Nyongeza.
Maeneo ya PACT ya kuweka misimbo ya protini au PKR yaliundwa kuwa pET15b (Addgene #73619) na kubadilishwa kuwa BL21(DE3).Bakteria hizo ziliangaziwa usiku kucha katika LB iliyotolewa na ampicillin na kisha kupunguzwa mara 100 na LB mpya.Wakati OD600 ya kati ilifikia 0.8, 1 mm IPTG iliongezwa ili kushawishi kujieleza kwa protini.Baada ya incubation mara moja kwa kutetemeka kwa upole (250 rpm saa 20 ° C), pellet ya seli ilikusanywa na centrifugation (4000 rpm, 10 min, 4 ° C).Simamisha pellet ya seli katika bafa ya lysis (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mm PMSF) na uanguke kwenye barafu kwa dakika 30, kisha sonicate (dakika 15, 5 s kuwasha/kuzima, kwenye barafu) na centrifuge (13,000). rpm)., dakika 30, 4° С).Kisha dawa hiyo ya juu ilipakiwa kwenye resin ya Ni-NTA (QIAGEN) mara 3 kwa 4°C, ikaoshwa mara 4 na bafa ya kuosha (50 mm Tris, pH 8.0, imidazole 40 mm, 250 mM NaCl) na kuondolewa mara 3, kwa jumla. ya mililita 10 za bafa (50 mm Tris, pH 8.0, 250 mm NaCl, 300 mm imidazole).Protini iliyosafishwa iliamuliwa kwa kutumia WB na mkusanyiko ulibainishwa kwa kutumia kifaa cha kupima protini cha Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Uchambuzi wa RIP ulifanyika kama ilivyoelezwa hapo awali, na marekebisho.Kwa ufupi, 1x RIP buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) cytostatic x cocktail (Roche, 1 mM DTT) na centrifuge kwa 13,000 rpm kwa dakika 15 kwa 4 °C.Kisha dawa hiyo ya ajabu iliwekwa ndani na protini A+G shanga za sumaku (Millipore) zilizounganishwa na 5 μg za anti-PACT antibody (Abeam) au IgG (CST).Shanga zilioshwa mara 5 kwa 5x RIP bafa, kisha kumeng'enywa na proteinase K (NEB).RNA ilitolewa kwa Trizol na kuamuliwa na RT-qPCR.Vitambulisho vimewasilishwa katika Jedwali la Nyongeza la 5.
Jaribio la in vitro RIP lilifanywa kulingana na itifaki ya upimaji ya kiwango cha RIP iliyorekebishwa.Jumla ya 5 pmol ya in vitro transcribed RNA ilipunguzwa 1x kwa bafa ya RIP na kuingizwa kwa incubation ifikapo 65°C kwa dakika 5 na kufuatiwa na kupoeza polepole hadi joto la kawaida.Jumla ya 5 pmol ya protini za PACT zisizobadilika au zilizobadilishwa zilizo na alama ya bendera zilisafishwa kutoka kwa E. koli.Ingiza kwa kutumia RNA iliyobadilishwa jina kwa saa 2 kwa 4°C na ufuate utaratibu ulio hapo juu wa uchanganuzi wa RIP kwa IP ya kuzuia bendera.
Kwa uchanganuzi wa kiendelezi cha RNA, seli 1×107 ziliwekwa bafa ya 1xRIP.Baada ya kuweka katikati kwa kasi ya 13,000 rpm kwa dakika 15 kwa 4°C, dawa ya juu ilitibiwa kabla na 30 μl ya shanga za sumaku za streptavidin (Beckman) kwa saa 2 kwa 4°C.Kisha lysate iliyosafishwa ilitolewa na tRNA ya chachu na kuingizwa na 40 pmol ya RNA iliyobadilishwa usiku mmoja saa 4 ° C, kisha kwa saa nyingine 2 na 20 μl ya shanga mpya za magneti za streptavidin zilizozuiwa na BSA ziliongezwa.Hatua ya kuosha ilijumuisha mara 4 na bafa ya 5x RIP na mara 4 na bafa 1x ya RIP.Protini zinazolingana zilitolewa kwa bafa ya biotin elution (25 mm Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mm D-biotin, PMSF) na kutenganishwa kwenye NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Baada ya rangi ya fedha (Beyotime Biotechnology), bendi fulani zilichambuliwa na kuchambuliwa na MS.
Uchanganuzi wa Co-IP ulifanywa ili kujaribu mwingiliano kati ya PACT na PKR.Kwa kifupi, lisati za nguvu za juu zilitayarishwa kwa kuangulia seli 1 x 107 za lysed katika 1 x RIP buffer ikifuatiwa na centrifugation saa 13,000 rpm kwa dakika 15 kwa 4°C.Lisaiti zilipakiwa na protini A + G shanga za sumaku, zilizounganishwa na 5 µg za kingamwili ya anti-PACT, na kuzungushwa kwa upole usiku kucha saa 4°C.Shanga zilioshwa mara 3 kwa 5×RIP bafa, mara mbili kwa 1×RIP bafa na eluted na 1×SDS bafa.Protini iliyopatikana ilichambuliwa na gel ya SDS-PAGE na kugunduliwa na WB.
Pmol mbili za PACT zilizoalamishwa na pmol 1 za PKR zilisafishwa kutoka kwa E. coli.Mimina katika 1× RIP bafa na uangulie kwa 10 pmol ya RNA iliyobadilishwa upya kwa saa 2 kwa 4 °C.Baada ya hapo, ziliwekwa kingamwili ya anti-labele ya protini A+G kwa saa mbili za ziada.Kisha shanga zilioshwa mara nne kwa 1x RIP bafa na kutolewa kwa 1x SDS bafa.Matokeo ya PACT na PKR yaligunduliwa na WB.