Habari

Asante kwa kutembelea Nature.com.Toleo la kivinjari unachotumia lina uwezo mdogo wa kutumia CSS.Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime Hali ya Upatanifu katika Internet Explorer).Wakati huo huo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tutatoa tovuti bila mitindo na JavaScript.
Mbinu za kuweka lebo za ukaribu wa kienzymatiki kulingana na esta zilizowashwa au radicals ya phenoksi hutumiwa sana kuweka ramani za proteomu za seli ndogo na viingiliano vya protini katika seli hai.Hata hivyo, esta zilizoamilishwa hazifanyi kazi tena, hivyo kusababisha radius pana ya kuweka lebo, na itikadi kali za phenoksi zinazozalishwa na matibabu ya peroksidi zinaweza kuingilia kati njia za redoksi.Hapa tunaripoti mbinu ya uanzishaji wa uwekaji lebo tegemezi (PDPL) iliyotengenezwa kwa kuunganisha kijeni protini ya miniSOG ya photosensitizer na protini inayokuvutia.Ikichochewa na mwanga wa buluu na kudhibitiwa na muda wa kukaribia aliyeambukizwa, oksijeni ya singlet huzalishwa na kisha uwekaji lebo wa mabaki ya histidine yaliyosuluhishwa kwa muda kwa kutumia kichunguzi cha anilini hupatikana.Tunaonyesha uaminifu wake wa juu kupitia ramani ya proteome maalum ya organelle.Ulinganisho wa kando kwa upande wa PDPL na TurboID unaonyesha chanjo mahususi zaidi na ya kina ya proteomic ya PDPL.Kisha, tulituma PDPL kwa kiambatanishi cha uandishi kinachohusiana na ugonjwa BRD4 na E3 Parkin ligase na tukapata viingiliano visivyojulikana hapo awali.Kwa uchunguzi wa kujieleza kupita kiasi, substrates mbili zisizojulikana, Ssu72 na SNW1, zilitambuliwa kwa Parkin, ambayo uharibifu wake unapatanishwa na njia ya ubiquitination-proteasome.
Uainishaji sahihi wa mitandao ya protini ni msingi wa michakato mingi ya kimsingi ya seli.Kwa hivyo, ramani sahihi ya anga ya anga ya mwingiliano wa protini itatoa msingi wa molekuli ya kufafanua njia za kibayolojia, ugonjwa wa ugonjwa, na kutatiza mwingiliano huu kwa madhumuni ya matibabu.Ili kufikia mwisho huu, mbinu zenye uwezo wa kuchunguza mwingiliano wa muda katika seli au tishu zilizo hai ni za kuhitajika sana.Affinity Purification Mass Spectrometry (AP-MS) imetumika kihistoria kutambua washirika wanaofunga wa protini zinazovutia (POIs).Pamoja na maendeleo ya mbinu za proteomics za kiasi, Bioplex3.0 iliundwa, hifadhidata kubwa zaidi ya mitandao ya protini kulingana na AP-MS.Ijapokuwa AP-MS ina nguvu sana, hatua za uchanganuzi na uchanganuzi wa seli katika utiririshaji wa kazi zinaegemea upande wa mwingiliano dhaifu na wa muda mfupi wa kumfunga na kuanzisha vizalia vya baada ya uchanganuzi kama vile jozi za mwingiliano wa uongo ambazo hazina utengano kabla ya uchanganuzi.
Ili kushughulikia masuala haya, asidi za amino zisizo asilia (UAA) zilizo na vikundi vya kuunganisha na mifumo ya uwekaji lebo ya enzymatic iliyo karibu (PL) (km APEX na BioID)5 imeundwa.Ingawa mbinu ya UAA imetumika kwa mafanikio katika hali nyingi na hutoa taarifa kuhusu viambatisho vya protini vya moja kwa moja, uboreshaji wa tovuti ya kuingiza UAA bado inahitajika.Muhimu zaidi, ni mbinu ya uwekaji lebo ya stoichiometric ambayo haina mabadiliko ya kichocheo ya matukio ya uwekaji lebo.Kinyume chake, mbinu za enzymatic PL, kama vile mbinu ya BioID, huunganisha ligase ya biotini iliyobuniwa hadi POI7, ambayo baadaye huwasha biotini kuunda esta tendaji ya biotinyl-AMP.Kwa hivyo kimeng'enya huchochea na kutoa "wingu" la biotini lililoamilishwa ambalo huandika mabaki ya lysine yaliyo karibu.Hata hivyo, BioID inahitaji zaidi ya saa 12 ili kupata mawimbi yenye lebo ya kutosha, ambayo yanazuia matumizi yake kwa azimio la muda.Kwa kutumia mageuzi yaliyoelekezwa kulingana na onyesho la chachu, TurboID iliundwa kulingana na BioID ili iwe na ufanisi zaidi, ikiruhusu uwekaji lebo bora kwa biotini ndani ya dakika 10, na kuruhusu michakato inayobadilika zaidi kuchunguzwa.Kwa sababu TurboID ni amilifu sana na viwango vya biotini asilia vinatosha kwa uwekaji lebo wa kiwango cha chini, uwekaji lebo wa usuli huwa tatizo linalowezekana wakati uwekaji lebo ulioboreshwa na ulioratibiwa unahitajika kwa kuongeza biotini ya kigeni.Kwa kuongeza, esta zilizoamilishwa hazifanyi kazi vizuri (t1/2 ~ 5 min), ambayo inaweza kusababisha radius kubwa ya lebo, hasa baada ya kueneza kwa protini za jirani na biotini 5. Katika mbinu nyingine, muunganisho wa kijeni wa peroxidase ya ascorbate (yaani biotin-) itikadi kali ya phenoli na huruhusu uwekaji alama wa protini ndani ya dakika 9,10. APEX hutumiwa sana kutambua proteome za seli ndogo, tata za protini za membrane, na tata za protini zinazoashiria cytosolic11,12. michakato ya seli.
Kwa hivyo, mbinu mpya inayoweza kutoa spishi tendaji zaidi za kukandamiza zenye lebo-radius na usahihi wa juu wa anga na wa muda bila kuharibu kwa kiasi kikubwa njia za seli itakuwa nyongeza muhimu kwa mbinu zilizopo. Miongoni mwa spishi tendaji, oksijeni ya singlet iliamsha usikivu wetu kwa sababu ya maisha yake mafupi na radius ndogo ya uenezaji (t1/2 <0.6 µs katika seli)13. Miongoni mwa spishi tendaji, oksijeni ya singlet iliamsha usikivu wetu kwa sababu ya maisha yake mafupi na radius ndogo ya uenezaji (t1/2 <0.6 µs katika seli)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии 3,1/31 (t. Miongoni mwa aina amilifu, oksijeni ya singlet ilivutia umakini wetu kwa sababu ya muda mfupi wa maisha na radius ndogo ya uenezaji (t1/2 <0.6 µs katika seli)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 <0.6 µs）而引起了我們的散3). 1/2 < 0.6 µs）而引起了我們的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса дифф16/ви ограниченного радиуса дифф16/ви2. Miongoni mwa aina amilifu, oksijeni ya singlet huvutia usikivu wetu kwa sababu ya muda mfupi wa maisha na radius ndogo ya uenezi (t1/2 <0.6 μs katika seli).Oksijeni ya sehemu moja imeripotiwa kuoksidisha kwa nasibu methionine, tyrosine, histidine na tryptophan, na kuifanya polar 14,15 kwa kushikamana na amini au thiol msingi probes16,17.Ingawa oksijeni ya singlet imetumiwa kuweka lebo ya sehemu ndogo ya seli za RNA, mikakati ya kurejesha alama za ukaribu wa POI bado haijachunguzwa.Hapa, tunawasilisha jukwaa liitwalo photoactivation-dependent proximity labeling (PDPL), ambapo tunatumia mwanga wa bluu kuangazia POI zilizounganishwa na miniSOG photosensitizer na kuchochea uzalishaji wa oksijeni wa singlet ili kuongeza oksidi mabaki ya karibu, ikifuatwa na marekebisho yaliyo na amini ili kuongeza oksidi za kemikali ndani. chembe hai za kati..Tulijaribu kikundi cha uchunguzi wa kemikali ili kuongeza umaalumu wa lebo na kubainisha tovuti za urekebishaji kwa kutumia utendakazi wazi wa proteomics.Ulinganisho wa kando kwa upande wa PDPL na TurboID unaonyesha chanjo mahususi zaidi na ya kina ya proteomic ya PDPL.Tulitumia mbinu hii kwa viambishi maalum vya organelle vya kitambulisho cha seli ndogo ya proteome na kitambulisho cha jumla cha proteome cha washirika wanaofunga kwa protini ya udhibiti wa epijenetiki inayohusishwa na saratani BRD4 na E3 ligase Parkin inayohusiana na ugonjwa wa Parkinson, ambayo ilithibitisha mtandao unaojulikana na usiojulikana wa protini. mwingiliano..Uwezo wa PDPL kutambua substrates E3 katika complexes kubwa ya protini inawakilisha hali ambapo utambuzi wa binders zisizo za moja kwa moja unahitajika.Sehemu ndogo mbili za parkin zisizojulikana zinazopatanishwa na ubiquitination-proteasome zimethibitishwa katika situ.
Tiba ya Photodynamic (PDT)19 na uamilisho wa leza inayosaidiwa na chromophore (CALI)20, ambapo mwalisho mwepesi wenye vihisishi vya photosensiti huzalisha oksijeni moja, unaweza kulemaza protini lengwa au kusababisha kifo cha seli.Kwa kuwa oksijeni ya singlet ni dutu inayofanya kazi sana yenye umbali wa kinadharia wa msambao wa takriban nm 70, oksidi ndogo ya anga karibu na photosensitizer inaweza kudhibitiwa.Kulingana na dhana hii, tuliamua kutumia oksijeni ya singlet kufikia uwekaji alama wa karibu wa muundo wa protini katika seli hai.Tumeunda mbinu ya PDPL ya chemoproteomic ili kutimiza kazi nne: (1) ili kuchochea uzalishaji wa oksijeni hai ya singlet sawa na mbinu ya enzymatic ya PL;(2) kutoa uwekaji lebo uliosuluhishwa kwa muda wakati mwanga unapoanzishwa;(3) kwa kubadilisha (4) Epuka kutumia viambajengo asilia (kama vile biotini) ili kupunguza mandharinyuma, au tumia vitendanishi vya nje vinavyosumbua sana (kama vile peroksidi) ili kupunguza mfiduo wa seli kwenye mkazo wa kimazingira.
Vifaa vya kupiga picha vinaweza kugawanywa katika makundi mawili ikiwa ni pamoja na fluorophore ndogo za uzito wa molekuli (kwa mfano rose bengal, methylene blue)22 na protini ndogo zilizosimbwa kwa vinasaba (km miniSOG, KillerRed)23.Ili kufikia muundo wa kawaida, tulitengeneza jukwaa la kizazi cha kwanza la PDPL kwa kuongeza protini za photosensitizer (PS) kwenye POI24,25 (Mchoro 1a).Inapoangaziwa na mwanga wa buluu, oksijeni ya singlet huoksidisha mabaki ya asidi ya amino ya nukleofili, na kusababisha polarity isiyopungua ambayo ni ya kielektroniki na inaweza kuguswa zaidi na nucleophiles16,17 ya amine.Uchunguzi umeundwa kwa mpini wa alkyne ili kuruhusu kemia ya kubofya na kubofya chini kwa sifa za LC/MS/MS.
Mchoro wa kimkakati wa uwekaji lebo wa muundo wa protini unaopatanishwa na miniSOG.Inapowekwa kwenye mwanga wa bluu, seli zinazoonyesha miniSOG-POI hutoa oksijeni moja, ambayo hurekebisha protini zinazoingiliana lakini si protini zisizofungamana.Bidhaa za kati za uoksidishaji wa picha hunaswa na lebo za relay za uchunguzi wa kemikali ya amine ili kuunda viongeza vya ushirika.Kundi la alkyyl kwenye uchunguzi wa kemia huruhusu kemia ya kubofya kwa uboreshaji kwa kuvuta-chini ikifuatiwa na hesabu ya LC-MS/MS.b Muundo wa kemikali wa probes za amine 1-4.c Uchanganuzi wakilishi wa jeli ya umeme wa alama za proteomic za mitochondrial zilizojanibishwa za miniSOG kwa kutumia vichunguzi 1-4 na ujazo wa jamaa kulingana na densitometry ya gel.Uwiano wa mawimbi kati ya usuli wa vichunguzi vya kemikali ulitathminiwa kwa kutumia majaribio hasi ya udhibiti bila kujumuisha mwanga wa bluu au kutumia seli za HEK293T bila usemi wa miniSOG.n = 2 sampuli zinazojitegemea kibayolojia.Kila nukta inawakilisha nakala ya kibiolojia.d Ugunduzi wakilishi na ukadiriaji wa PDPL kwa kutumia uchunguzi ulioboreshwa 3 ikiwa kuna au kutokuwepo kwa vijenzi vya PDPL vilivyoonyeshwa kama c.n = sampuli 3 zinazojitegemea kibayolojia.Kila nukta inawakilisha nakala ya kibiolojia.Mistari ya katikati na sharubu huwakilisha wastani na ± mkengeuko wa kawaida.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Upigaji picha unaofanana wa oksijeni ya singlet yenye doa la Si-DMA la rangi nyekundu.Upau wa kipimo: 10 µm.Upigaji picha wa gel na majaribio ya kuchanganya yalirudiwa kwa kujitegemea angalau mara mbili na matokeo sawa.
Tulijaribu kwanza uwezo wa photosensitizers iliyokomaa miniSOG26 na KillerRed23, iliyoonyeshwa kwa uthabiti katika HEK293T, kupatanisha uwekaji lebo ya propargylamine ya proteome kama uchunguzi wa kemikali (Mchoro wa Nyongeza 1a).Uchanganuzi wa fluorescence ya gel ulionyesha kuwa uwekaji lebo nzima wa proteome ulipatikana kwa kutumia miniSOG na miale ya mwanga wa buluu, wakati hakuna bidhaa inayoonekana ya lebo iliyozingatiwa na KillerRed.Ili kuboresha uwiano wa ishara-kwa-chinichini, kisha tulijaribu seti ya vichunguzi vya kemikali vilivyo na anilini (1 na 3), propylamine (2), au benzylamine (4).Tuliona kwamba seli za HEK293T zenyewe zilikuwa na mawimbi ya juu zaidi ya mandharinyuma ikilinganishwa na kutokuwa na mwanga wa samawati, labda kutokana na photosensitizer asilia ya riboflauini, flavin mononucleotide (FMN) 27 . Vichunguzi vya kemikali vinavyotokana na aniline 1 na 3 vilitoa umaalum bora zaidi, huku HEK293T ikionyesha miniSOG kwa uthabiti katika mitochondria ikionyesha ongezeko la > mara 8 la mawimbi ya uchunguzi wa 3, huku uchunguzi wa 2 ukitumika katika mbinu ya kuweka lebo ya RNA CAP-seq ikionyesha ~2.5- pekee ongezeko la ishara ya mara, uwezekano kutokana na mapendekezo tofauti reactivity kati ya RNA na protini (Mtini. 1b, c). Vichunguzi vya kemikali vinavyotokana na aniline 1 na 3 vilitoa umaalum bora zaidi, huku HEK293T ikionyesha miniSOG kwa uthabiti katika mitochondria ikionyesha ongezeko la > mara 8 la mawimbi ya uchunguzi wa 3, huku uchunguzi wa 2 ukitumika katika mbinu ya kuweka lebo ya RNA CAP-seq ikionyesha ~2.5- pekee ongezeko la ishara ya mara, uwezekano kutokana na mapendekezo tofauti reactivity kati ya RNA na protini (Mtini. 1b, c).Vichunguzi vya kemikali vinavyotokana na aniline 1 na 3 vilionyesha umaalum bora zaidi: HEK293T, ambayo huonyesha miniSOG kwa uthabiti katika mitochondria, inaonyesha zaidi ya ongezeko la mara 8 la mawimbi ya uchunguzi wa 3, huku uchunguzi wa 2, unaotumika katika mbinu ya kuweka lebo ya CAP-seq RNA, pekee. inaonyesha ~ ongezeko la ishara mara 2.5, pengine kutokana na mapendeleo tofauti ya utendakazi kati ya RNA na protini (Mchoro 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性 特异性 特异性 探针 3 探针 在 线 粒体 粒体 中 稳定 表达 表达 于 标记 3 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）.基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 特异性 特异性 探针 3 -倍信号增加，可能是由于RNAVichunguzi vya kemikali vinavyotokana na aniline 1 na 3 vilikuwa na umaalum bora zaidi, HEK293T ilionyesha miniSOG kwa uthabiti katika mitochondria, na uchunguzi wa 3 ulikuwa na ongezeko la mara 8 la mawimbi, huku uchunguzi wa 2 wa mbinu ya kuweka lebo ya CAP-seq RNA ulionyesha ongezeko la ~2.5 pekee.katika ishara, pengine kutokana na mapendekezo tofauti ya mmenyuko kati ya RNA na protini (Mchoro 1b, c).Kwa kuongeza, probe 3 isoma na hydrazine probes (probes 5, 6, 7) zilijaribiwa, kuthibitisha uboreshaji wa uchunguzi wa 3 (Mchoro wa ziada 1b, c).Vile vile, uchanganuzi wa fluorescence katika gel ulifunua vigezo vingine vya majaribio vilivyoboreshwa: urefu wa wimbi la mionzi (nm 460), ukolezi wa uchunguzi wa kemikali (1 mM), na muda wa mnururisho (dakika 20) (Mchoro wa Nyongeza 2a-c).Kuacha sehemu yoyote au hatua katika itifaki ya PDPL ilisababisha ugeuzaji mkubwa wa ishara kwenye usuli (Mchoro 1d).Hasa, uwekaji alama wa protini ulipunguzwa kwa kiasi kikubwa mbele ya azide ya sodiamu au trolox, ambayo inajulikana kuzima oksijeni ya singlet.Uwepo wa D2O, ambayo inajulikana kuleta utulivu wa oksijeni ya singlet, huongeza ishara ya lebo.Ili kuchunguza mchango wa spishi nyingine tendaji za oksijeni kwa kuweka lebo, mannitol na vitamini C ziliongezwa ili kuanzisha hydroxyl na superoxide radical scavengers, kwa mtiririko huo, 18, 29, lakini hazikupatikana kupunguza uwekaji lebo.Ongezeko la H2O2, lakini si kuangaza, halikusababisha kuweka lebo (Mchoro wa ziada wa 3a).Upigaji picha wa oksijeni wa singlet ya fluorescence kwa kutumia vichunguzi vya Si-DMA ulithibitisha kuwepo kwa oksijeni ya singlet kwenye waya wa HEK293T-miniSOG, lakini si katika waya asilia ya HEK293T.Kwa kuongeza, mitoSOX Nyekundu haikuweza kutambua uzalishaji wa superoxide baada ya kuangaza (Kielelezo 1e na Kielelezo cha 3b cha Nyongeza) 30. Data hizi zinapendekeza sana kwamba oksijeni ya singlet ndiyo spishi kuu ya oksijeni tendaji inayowajibika kwa uwekaji lebo wa proteomic.Cytotoxicity ya PDPL ilitathminiwa ikiwa ni pamoja na miale ya mwanga wa bluu na uchunguzi wa kemikali, na hakuna cytotoxicity muhimu ilizingatiwa (Mchoro wa ziada wa 4a).
Ili kusoma utaratibu wa kuweka lebo na kuwezesha utambuzi wa proteomic wa changamano za protini kwa kutumia LC-MS/MS, tunahitaji kwanza kubainisha ni asidi gani za amino zinazorekebishwa na wingi wa delta wa lebo za uchunguzi.Methionine, histidine, tryptophan na tyrosine zimeripotiwa kubadilishwa na oksijeni ya singlet14,15.Tunaunganisha mtiririko wa kazi wa TOP-ABPP31 na utafutaji wazi usio na upendeleo unaotolewa na mfumo wa kompyuta wa FragPipe kulingana na MSFragger32.Baada ya urekebishaji wa oksijeni ya singlet na lebo ya uchunguzi wa kemikali, kemia ya kubofya ilifanywa kwa kutumia lebo ya kupunguza biotini iliyo na kiunganishi kinachoweza kupasuka, ikifuatiwa na kunyoosha kwa neutravidin na usagaji wa trypsin.Peptidi iliyorekebishwa, bado imefungwa kwenye resini, ilitolewa kwa ajili ya uchambuzi wa LC-MS/MS (Mchoro 2a na Data ya Ziada 1).Idadi kubwa ya marekebisho yalitokea kote kwenye proteome na zaidi ya ramani 50 za peptidi zinazolingana (PSM) zimeorodheshwa (Mchoro 2b).Kwa kushangaza, tuliona tu marekebisho ya histidine, pengine kutokana na utendakazi mkubwa wa histidine iliyooksidishwa kuelekea kwenye uchunguzi wa anilini kuliko asidi nyingine za amino.Kulingana na utaratibu uliochapishwa wa uoksidishaji wa histidine kwa oksijeni ya singlet,21,33 muundo wa delta-mass uliopendekezwa wa +229 Da unalingana na upitishaji wa probe 3 na 2-oxo-histidine baada ya vioksidishaji viwili, wakati +247 Da ni bidhaa ya hidrolisisi. ya +229 Da (Mtini. 5 wa Nyongeza).Tathmini ya wigo wa MS2 ilionyesha kuegemea juu kwa utambuzi wa ioni nyingi za y na b, pamoja na utambuzi wa ioni za vipande vilivyobadilishwa (y na b) (Mchoro 2c).Uchambuzi wa muktadha wa mlolongo wa ndani wa histidines zilizobadilishwa PDPL ulifunua upendeleo wa wastani wa motif kwa mabaki madogo ya hydrophobic kwenye nafasi za ± 1 (Mchoro wa ziada wa 4b).Kwa wastani, histidines 1.4 zilitambuliwa kwa kila protini, na maeneo ya alama hizi ziliamuliwa na eneo la uso la kutengenezea (SASA) na uchambuzi wa upatikanaji wa kutengenezea (RSA) (Mchoro wa ziada wa 4c, d).
Mtiririko wa kazi usio na upendeleo wa kusoma uteuzi wa mabaki kwa kutumia mfumo wa kompyuta wa FragPipe unaoendeshwa na MSFragger.Viunga vinavyoweza kufutwa vinatumika katika kemia ya Bofya ili kuruhusu upenyo wa peptidi zilizorekebishwa kutoka kwa resini ya streptavidin.Utafutaji wa wazi ulizinduliwa ili kutambua marekebisho mengi, pamoja na masalio husika.b Agiza wingi wa marekebisho yanayotokea kote kwenye proteome.Ramani ya Peptide PSM.c Ufafanuzi wa kuvutia wa MS2 wa tovuti za histidine zilizorekebishwa kwa uchunguzi 3. Kama mfano mwakilishi, mmenyuko wa ushirikiano na uchunguzi 3 uliongezwa +229.0938 Da kwenye asidi ya amino iliyorekebishwa.d Jaribio la mabadiliko linalotumika kufanyia vipimo vya alama za PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) na PRDX1 (H10A, H81A, H169A) zilipitishwa kwa plasmidi za aina ya mwitu kwa ajili ya kutambua kupambana na Bendera.e Peptidi ya syntetisk ilichukuliwa na miniSOG iliyosafishwa mbele ya uchunguzi 3 na bidhaa zinazolingana na Δm +247 na +229 zilibainishwa katika wigo wa LC-MS.f Mwingiliano wa protini-kwa-protini katika muundo wa ndani ulio na miniSOG-6xHis-tag na anti-6xHis antibody.Antibiotini (streptavidin-HRP) na uchanganuzi wa kinga dhidi ya panya wa Magharibi wa miniSOG-6xHis/anti-6x Kingamwili chake changamani kilicho na alama 3, kulingana na muda wa kufichuliwa na mwanga.Lebo za protini za kibinafsi zinaonyeshwa katika uzani unaolingana wa Masi: mnyororo wa mwanga wa kingamwili wa LC, mnyororo mzito wa kingamwili wa HC.Majaribio haya yalirudiwa kwa kujitegemea angalau mara mbili na matokeo sawa.
Kwa uthibitishaji wa biokemikali wa tovuti ya kuweka lebo, PRDX3 na PRDX1 zilizotambuliwa na spectrometry ya wingi zilibadilishwa kutoka histidine hadi alanine na ikilinganishwa na aina ya mwitu katika majaribio ya maambukizi.Matokeo ya PDPL yalionyesha kuwa mabadiliko hayo yalipunguza sana uwekaji alama (Mchoro 2d).Wakati huo huo, mlolongo wa peptidi uliotambuliwa katika utafutaji wa wazi uliunganishwa na kuguswa kwa vitro na miniSOG iliyosafishwa mbele ya uchunguzi 3 na mwanga wa bluu, ikitoa bidhaa na mabadiliko makubwa ya +247 na +229 Da wakati iligunduliwa na LC-MS (Mtini. . 2e).)Ili kupima kama protini zinazokaribiana zinazoingiliana zinaweza kuwekewa lebo ya in vitro kutokana na uwezeshaji wa picha wa miniSOG, tulitengeneza kipimo bandia cha ukaribu kwa mwingiliano kati ya miniSOG-6xHis protini na kizuia kingamwili Wake monokloni katika vitro (Mchoro 2f).Katika jaribio hili, tulitarajia uwekaji lebo karibu zaidi wa minyororo nzito na nyepesi ya kingamwili kwa miniSOG.Kwa kweli, anti-panya (kutambua minyororo nzito na nyepesi ya anti-6xHis-labeled antibody) na streptavidin blots za Magharibi zilionyesha biotinylation kali ya minyororo nzito na nyepesi.Hasa, tuligundua miniSOG autobiotinylation kutokana na tagi ya 6xHis na viunganishi kati ya minyororo nyepesi na nzito, ambayo inaweza kuhusiana na pengo lililoelezwa hapo awali kati ya lysine na 2-oxo-histidine majibu ya karibu.Kwa kumalizia, tunahitimisha kuwa PDPL hurekebisha histidine kwa njia inayotegemea ukaribu.
Lengo letu lililofuata lilikuwa kuainisha proteome ndogo ya seli ili kujaribu umaalum wa uwekaji lebo katika situ.Kwa hiyo, tulieleza kwa uthabiti miniSOG katika kiini, tumbo la mitochondrial, au utando wa nje wa ER wa seli za HEK293T (Mchoro 3a).Uchanganuzi wa fluorescence ya gel ulibaini bendi nyingi zilizo na lebo katika maeneo matatu ya seli ndogo pamoja na mifumo tofauti ya uwekaji lebo (Mchoro 3b).Uchambuzi wa picha za fluorescence ulionyesha umaalumu mkubwa wa PDPL (Mchoro 3c).Mtiririko wa kazi wa PDPL ulifuatiwa na mibofyo ya mibofyo yenye rangi za rhodamine ili kubainisha proteomu ndogo za seli kwa kutumia hadubini ya fluorescence, na mawimbi ya PDPL yaliunganishwa na DAPI, vifuatiliaji vya mitochondrial, au vifuatiliaji vya ER, kuthibitisha uaminifu wa hali ya juu wa PDPL.Kwa maeneo hayo matatu, ulinganisho wa kando kwa upande wa PDPL na TurboID kwa kutumia avidin western blot ulionyesha kuwa PDPL iliwekwa lebo mahususi zaidi ikilinganishwa na vidhibiti vyao husika.Chini ya hali ya PDPL, bendi zenye lebo zaidi zilionekana, zikionyesha protini zaidi zilizo na lebo ya PDPL (Mchoro wa Nyongeza 6a-d).
uwakilishi wa Kiratibu wa uwekaji lebo maalum wa proteome ya miniSOG-mediated organelle.miniSOG inalenga tumbo la mitochondrial kupitia muunganisho hadi N-terminal 23 amino asidi ya binadamu COX4 (mito-miniSOG), kiini kupitia muunganisho hadi H2B (nucleus-miniSOG), na Sec61β kupitia upande wa sitoplasmic wa membrane ya ER (ER-miniSOG). )Dalili ni pamoja na upigaji picha wa jeli, upigaji picha unaofanana, na utazamaji wa wingi.b Picha za jeli zinazowakilisha wasifu wa PDPL tatu maalum wa organelle.CBB Coomassie Bluu ya Kipaji.c Picha wakilishi za mwonekano wa seli za HEK293T zinazoonyesha miniSOG kwa uthabiti na ujanibishaji tofauti wa seli ndogo zilizogunduliwa na kingamwili inayoitwa V5 (nyekundu).Alama ndogo za seli hutumiwa kwa mitochondria na ER (kijani).Mtiririko wa kazi wa PDPL unajumuisha ugunduzi wa miniSOG (njano) iliyo na lebo ya proteomu za seli ndogo kwa kutumia kemia ya kubofya ya Cy3-azide.Upau wa kipimo: 10 µm.d Viwanja vya volkeno vya proteome zilizowekwa alama za PDPL katika viungo mbalimbali vilivyohesabiwa kwa ukadiriaji usio na lebo (n = 3 majaribio huru ya kibiolojia).Jaribio la T la Mwanafunzi lenye mikia miwili lilitumika kwenye viwanja vya volcano.HEK293T aina ya mwitu ilitumika kama udhibiti hasi. Protini zilizobadilishwa kwa kiasi kikubwa zimeangaziwa kwa rangi nyekundu (p <0.05 na> tofauti ya kiwango cha ioni mara 2). Protini zilizobadilishwa kwa kiasi kikubwa zimeangaziwa kwa rangi nyekundu (p <0.05 na> tofauti ya kiwango cha ioni mara 2). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Protini zilizobadilishwa kwa kiasi kikubwa zimeangaziwa kwa rangi nyekundu (p <0.05 na> tofauti ya mara 2 katika kiwango cha ioni).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Protini zilizobadilishwa kwa kiasi kikubwa zimeangaziwa kwa rangi nyekundu (p <0.05 na> tofauti ya mara 2 katika nguvu ya ionic).Protini zinazohusiana muhimu kwa HEK293T-miniSOG lakini sio muhimu kwa HEK293T zinaonyeshwa kwa kijani.e Uchambuzi wa umahususi wa seti za data za proteomic kutoka kwa majaribio d.Jumla ya idadi ya protini muhimu kitakwimu katika kila kiungo (doti nyekundu na kijani) imewekwa alama juu.Histogramu huonyesha protini zilizojanibishwa katika viungo kulingana na MitoCarta 3.0, uchanganuzi wa GO na A. Ting et al.watu.Tenganisha seti za data za mitochondria, viini, na ER.Majaribio haya yalirudiwa kwa kujitegemea angalau mara mbili na matokeo sawa.Data ghafi hutolewa katika mfumo wa faili ghafi za data.
Kwa kuhimizwa na matokeo ya jeli na picha, ukadiriaji usio na lebo ulitumiwa kuhesabu proteome iliyotambuliwa katika kila kiungo (Data ya Ziada 2).HEK293T ambayo haijaambukizwa ilitumika kama kidhibiti hasi ili kutoa alama za mandharinyuma. Uchanganuzi wa njama ya volcano ulionyesha protini zilizoimarishwa kwa kiasi kikubwa (p <0.05 na > 2-fold ion intensiteten) pamoja na protini za singleton ambazo zipo tu katika mistari ya kueleza miniSOG (Mchoro 3d dots nyekundu na kijani). Uchanganuzi wa njama ya volcano ulionyesha protini zilizoimarishwa kwa kiasi kikubwa (p <0.05 na > 2-fold ion intensiteten) pamoja na protini za singleton ambazo zipo tu katika mistari ya kueleza miniSOG (Mchoro 3d dots nyekundu na kijani). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Uchambuzi wa njama ya volkano ulionyesha protini zilizoimarishwa kwa kiasi kikubwa (p<0.05 na>ukali wa ioni mara 2) pamoja na protini moja ambazo zipo tu katika mistari ya kueleza miniSOG (Mchoro 3d, dots nyekundu na kijani).火山图分析显示出显着富集的蛋白质（p <0.05 和>2 倍离子强度）以及仅存在纎MINISOG 一亲边存在纎miniSOG 一亲軅存在纎miniSOG 一火山图 分析 显示 出 显着 蛋白质 （（p <0.05 和> 2 倍 强度）） 仅 存 在于 在于 在于 表达 的 Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Uchanganuzi wa njama ya volkano ulifunua protini zilizoimarishwa kwa kiasi kikubwa (p<0.05 na >2x nguvu ya ionic) pamoja na protini moja zilizopo kwenye mstari wa kujieleza wa miniSOG (doti nyekundu na kijani kwenye Mchoro 3d).Kwa kuchanganya data hizi, tulitambua 1364, 461, na 911 muhimu kitakwimu za nyuklia, mitochondrial na protini za utando wa nje za ER, mtawalia.Ili kuchanganua usahihi wa PDPL iliyojanibishwa na viungo, tulitumia uchanganuzi wa MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO), na A. Ting et al.seti ya data8 ilitumiwa kwa mitochondria, kiini, na ER ili kupima maalum ya organelle ya protini zilizogunduliwa, zinazofanana na usahihi wa 73.4, 78.5, na 73.0% (Mchoro 3e).Umaalumu wa PDPL unathibitisha kuwa PDPL ni zana bora ya kutambua proteomu mahususi za organelle.Hasa, uchanganuzi wa uwasilishaji wa protini za mitochondrial zilizotambuliwa ulionyesha kuwa proteome iliyonaswa ilisambazwa zaidi kwenye tumbo na utando wa ndani (226 na 106, mtawalia), ikichukua 91.7% (362) ya jumla ya idadi ya protini za mitochondrial zilizotambuliwa.kiwango cha juu cha PDPL kilithibitishwa zaidi (Mchoro wa Nyongeza 7a).Vile vile, uchambuzi wa nyuklia ulionyesha kuwa proteome iliyokamatwa ilisambazwa zaidi katika nucleus, nucleoplasm, na nucleolus (Supplementary Fig. 7b).Uchanganuzi wa proteomic ya nyuklia na peptidi ya mawimbi ya ujanibishaji wa nyuklia (3xNLS) ulionyesha usahihi sawa na muundo wa H2B (Mchoro wa Nyongeza 7c-h).Ili kubainisha umahususi wa kialama cha PDPL, lamiin A ya nyuklia ilichaguliwa kama mtego wa POI7 uliowekwa kwa uwazi zaidi.PDPL ilitambua protini 36 zilizorutubishwa kwa kiasi kikubwa, ambapo protini 12 (30.0% ikiwa ni pamoja na lamin A) zilikuwa na sifa nzuri za protini za lamin A zilizofafanuliwa na hifadhidata ya String, kwa asilimia kubwa kuliko mbinu ya BioID (protini 122) 28 kati ya 28. , 22.9 %) 7. Mbinu yetu ilitambua protini chache, ikiwezekana kutokana na maeneo machache ya kuweka lebo, ambayo yaliwezeshwa na oksijeni amilifu zaidi ya singlet.Uchanganuzi wa GO ulionyesha kuwa protini zilizotambuliwa zilikuwa hasa kwenye nucleoplasm (26), utando wa nyuklia (10), utando wa nyuklia (9), na pores za nyuklia (5).Kwa pamoja, protini hizi za nyuklia-localized zilichangia 80% ya protini zilizoboreshwa, na kuonyesha zaidi umaalumu wa PDPL (Mchoro wa ziada wa 8a-d).
Baada ya kubaini uwezo wa PDPL kutekeleza alama za ukaribu katika viungo, kisha tukajaribu kama PDPL inaweza kutumika kuchanganua washirika wanaofunga POI.Hasa, tulitafuta kufafanua uchanganuzi wa PDPL wa protini za sitosoli, ambazo huchukuliwa kuwa shabaha ngumu zaidi kuliko wenzao walio na utando wa ujanibishaji kutokana na asili yao inayobadilika sana.Protini ya bromodomain na extraterminal (BET) BRD4 imevutia umakini wetu kwa jukumu lake kuu katika magonjwa mbalimbali 35, 36 .Mchanganyiko unaoundwa na BRD4 ni coactivator ya transcriptional na lengo muhimu la matibabu.Kwa kudhibiti usemi wa vipengele vya unukuzi vya c-myc na Wnt5a, BRD4 inadhaniwa kuwa kigezo kikuu cha leukemia kali ya myeloid (AML), myeloma nyingi, lymphoma ya Burkitt, saratani ya koloni na magonjwa ya uchochezi37,38.Kwa kuongezea, virusi vingine vinalenga BRD4 kudhibiti unukuzi wa virusi na simu za mkononi, kama vile papillomavirus, VVU, na SARS-CoV-236,39.
Ili kuweka ramani ya mwingiliano wa BRD4 kwa kutumia PDPL, tuliunganisha miniSOG na isoform fupi ya N- au C-terminal ya BRD4.Matokeo ya kiproteomiki yalifichua kiwango cha juu cha mwingiliano kati ya miundo miwili (Mchoro wa Nyongeza 9a).Proteome ya nyuklia inayotambuliwa na miniSOG-H2B inashughulikia 77.6% ya protini zinazoingiliana na BRD4 (Mchoro wa Nyongeza 9b).Kisha, nyakati tofauti za kuangaza (2, 5, 10, 20 min) zilitumiwa kurekebisha radius ya alama (Mchoro 4a na data ya ziada 3).Tunahitimisha kuwa katika vipindi vifupi vya kupiga picha, PDPL itaweka lebo ya washirika wanaofunga moja kwa moja, ilhali muda mrefu utajumuisha protini zinazotambuliwa katika muda mfupi wa uwezeshaji picha na vile vile malengo yasiyo ya moja kwa moja katika miundo ya uwekaji lebo.Kwa hakika, tulipata mwingiliano mkubwa kati ya pointi za wakati zilizo karibu (84.6% kwa dakika 2 na 5; 87.7% kwa dakika 5 na 10; 98.7% kwa dakika 10 na 20) (Mchoro 4b na Kielelezo cha Nyongeza 9c).Katika vikundi vyote vya majaribio, hatukupata tu kujitambulisha kwa BRD4, lakini malengo kadhaa yanayojulikana kama vile MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, na HMGB1 yamebainishwa kwenye hifadhidata ya mifuatano.Nguvu ya ioni ya shabaha hizi inalingana na wakati wa mfiduo (Kielelezo 4c na Kielelezo cha 9d cha Nyongeza).Uchambuzi wa GO wa protini zilizotambuliwa katika kundi la dakika 2 ulionyesha kuwa protini zilizotambuliwa ziliwekwa ndani kwenye kiini na zilihusika katika urekebishaji wa chromatin na utendakazi wa polimerasi ya RNA.Kazi ya molekuli ya protini iliimarishwa katika kuunganisha chromatin au uanzishaji wa transcriptional, kulingana na kazi ya BRD4 (Mchoro 4d).Uchanganuzi wa mwingiliano wa protini uliowezeshwa na hifadhidata ulifunua kiwango cha kwanza cha mwingiliano usio wa moja kwa moja kati ya BRD4 na HDAC tata zinazoingiliana za familia kama vile SIN3A, NCOR2, BCOR, na SAP130 (Mchoro 4e na Mchoro wa 9e wa Nyongeza), kulingana na BRD4 na HDAC inayofunga histones ya acetylated. ..Kwa kuongeza, malengo ya uwakilishi yaliyotambuliwa na LC-MS/MS, ikiwa ni pamoja na Sin3A, NSUN2, Fus, na SFPQ, yalithibitishwa na Western blotting (Mchoro 4f).Hivi majuzi, isoform fupi ya BRD4 imeripotiwa kuunda viini vyenye sifa za utengano wa awamu ya kioevu-kioevu (LLPS).Protini zinazofunga RNA Fus na SFPQ hupatanisha LLPS ya michakato mbalimbali ya seli na zimetambuliwa hapa kama protini zinazofunga BRD4 ambazo hazijarekodiwa.Mwingiliano kati ya BRD4 na SFPQ ulithibitishwa na majaribio ya uingizaji wa kinga mwilini (co-IP) (Mchoro 4g), ikipendekeza utaratibu mwingine wa utenganisho wa awamu ya kioevu-kioevu unaopatana na BRD4 unaostahili uchunguzi zaidi.Yakijumlishwa, matokeo haya yanapendekeza kuwa PDPL ni jukwaa bora la kutambua BRD4 inayoingiliana na vile vile protini zinazofungamanisha zisizojulikana.
uwakilishi wa Kiratibu wa kuashiria ukaribu wa miniSOG-mediated BRD4, nyakati za kukaribia aliyeambukizwa: 2, 5, 10, na 20 dakika.b Muingiliano wa protini unaotambuliwa kwa nyakati tofauti za mwanga.Urutubishaji wa protini uliotambuliwa katika HEK293T-miniSOG-BRD4 ulikuwa muhimu kitakwimu ikilinganishwa na HEK293T ya aina ya mwitu.c Uzito wa ioni wakati wa kukadiria mwakilishi ambaye hana lebo inayojulikana kuwa BRD4-binding protini wakati wa kukaribia aliyebainishwa.n = sampuli 3 zinazojitegemea kibayolojia.Data huwasilishwa kama wastani ± mkengeuko wa kawaida.d Uchanganuzi wa ontolojia wa jeni (GO) wa protini zilizotambuliwa katika kikundi cha dakika 2.Masharti kumi ya kwanza ya GO yameorodheshwa.Viputo hutiwa rangi kulingana na aina ya neno la GO, na ukubwa wa viputo hulingana na idadi ya protini zinazopatikana katika kila neno.e Uchambuzi wa kamba wa protini zinazoingiliana na BRD4.Miduara ya njano ni gundi moja kwa moja na miduara ya kijivu ni safu ya kwanza ya gundi isiyo ya moja kwa moja.Mistari nyekundu inawakilisha mwingiliano ulioamuliwa kwa majaribio na mistari ya samawati inawakilisha mwingiliano uliotabiriwa.f Malengo ya kumfunga BRD4 Mwakilishi yaliyotambuliwa katika LC-MS/MS yalithibitishwa na ukaushaji wa Magharibi.g Majaribio ya uingizaji wa kinga ya mwili pamoja yanathibitisha mwingiliano kati ya SFPQ na BRD4.Majaribio haya yalirudiwa kwa kujitegemea angalau mara mbili na matokeo sawa.Data ghafi hutolewa katika mfumo wa faili ghafi za data.
Pamoja na kutambua shabaha zinazohusishwa na POI ambazo hazijasajiliwa, tunakisia kuwa PDPL itafaa kwa kutambua viambajengo vidogo vya vimeng'enya, ambavyo vitahitaji ubainifu wa protini zinazofungana zisizo za moja kwa moja katika miundo mikubwa ili kufafanua substrates ambazo hazijasajiliwa.Parkin (iliyosimbwa na PARK2) ni ligase E3 na mabadiliko katika parkin yanajulikana kusababisha ugonjwa wa autosomal recessive juvenile Parkinson (AR-JP)42.Kwa kuongezea, parkin imeelezwa kuwa muhimu kwa mitophagy (mitochondrial autophagy) na kuondolewa kwa spishi tendaji za oksijeni.Walakini, ingawa substrates kadhaa za parkin zimetambuliwa, jukumu la parkin katika ugonjwa huu bado haijulikani wazi.Ili kufafanua substrates zake zisizo na sifa, PDPL ilijaribiwa kwa kuongeza miniSOG kwenye N- au C-terminus ya parkin.Seli zilitibiwa kwa kisafirishaji cha protoni ya carbonyl sianidi m-chlorophenylhydrazone (CCCP) ili kuwezesha parkin kupitia njia ya PINK1-Parkin.Ikilinganishwa na matokeo yetu ya BRD4 PDPL, muunganisho wa parkin N-terminus ulifichua seti kubwa ya protini lengwa, ingawa ilifunika sehemu kubwa ya C-terminus (177 kati ya 210) (Mchoro 5a,b na Data ya Ziada 4).matokeo yanaendana na ripoti kwamba lebo za N-terminal zinaweza kuwezesha Parkin44 kimakosa.Jambo la kushangaza ni kwamba, kulikuwa na protini 18 pekee zinazopishana katika data zetu zilizo na matokeo ya AP-MS yaliyochapishwa ya Parkin43, ambayo huenda ni kwa sababu ya tofauti kati ya mistari ya seli na mtiririko wa kazi wa proteomics.Mbali na protini nne zinazojulikana (ARDM1, HSPA8, PSMD14, na PSMC3) zinazotambuliwa na mbinu mbili (Mchoro 5c)43.Ili kuthibitisha zaidi matokeo ya LC-MS/MS, matibabu ya PDPL na ukaushaji uliofuata wa Magharibi yalitumiwa kulinganisha matokeo ya uchanganuzi wa seli kuu za HEK293T na laini thabiti ya N-terminal parkin.Malengo ya awali yasiyojulikana CDK2, DUT, CTBP1, na PSMC4 yalijaribiwa kwa kiunganisha kinachojulikana, DNAJB1 (Mchoro 5d).
Mpango wa volkeno wa protini zinazoingiliana na parkin katika seli za HEK293T zilizo na miniSOG iliyoonyeshwa kwa uthabiti iliyounganishwa kwa N- au C-terminus ya parkin (n = 3 majaribio huru ya kibiolojia).Jaribio la T la Mwanafunzi lenye mikia miwili lilitumika kwenye viwanja vya volcano.HEK293T ilitumika kama kidhibiti hasi. Protini zilizobadilishwa kwa kiasi kikubwa zimeangaziwa kwa rangi nyekundu (p <0.05 na> tofauti ya kiwango cha ioni mara 2). Protini zilizobadilishwa kwa kiasi kikubwa zimeangaziwa kwa rangi nyekundu (p <0.05 na> tofauti ya kiwango cha ioni mara 2). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Protini zilizobadilishwa kwa kiasi kikubwa zimeangaziwa kwa rangi nyekundu (p <0.05 na> tofauti ya mara 2 katika kiwango cha ioni).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Protini zilizobadilishwa kwa kiasi kikubwa zimeangaziwa kwa rangi nyekundu (p <0.05 na> tofauti ya mara 2 katika nguvu ya ionic).Protini zinazohusiana muhimu kwa HEK293T-miniSOG lakini sio muhimu kwa HEK293T zinaonyeshwa kwa kijani.b Mchoro wa Venn unaoonyesha protini zinazopishana kati ya miundo ya N-terminal na C-terminal.Lebo za N-terminal zinaweza kuwezesha parkin kimagendo na kusababisha protini zinazotambulika zaidi.c Mchoro wa Venn unaoonyesha protini zinazopishana kati ya PDPL na AP-MS.Viingiliano vinavyojulikana vimeorodheshwa, ikijumuisha protini 4 kati ya 18 zinazopishana na 11 kati ya protini 159 zilizotambuliwa mahususi katika PDPL.d Malengo ya uwakilishi yaliyotambuliwa na LC-MS/MS yalithibitishwa na ukaushaji wa Magharibi.e Ssu72 na SNW1 zilitambuliwa kama sehemu ndogo za bustani ambazo hazijasajiliwa.Plasmaidi hizi za protini zilizo na lebo ya BENDERA zilipitishwa kuwa HEK293T na HEK293T-Parkin-miniSOG ikifuatwa na matibabu ya CCCP kwa nyakati tofauti.Uharibifu huo ulitamkwa zaidi katika mstari wa kujieleza wa Parkin.f Kwa kutumia kizuizi cha proteasome MG132, ilithibitishwa kuwa mchakato wa uharibifu wa Ssu72 na SNW1 unapatanishwa na proteasome-ubiquitination.Majaribio haya yalirudiwa kwa kujitegemea angalau mara mbili na matokeo sawa.Data ghafi hutolewa katika mfumo wa faili ghafi za data.
Hasa, protini zilizotambuliwa na PDPL lazima zijumuishe protini zinazofunga parkin na substrates zao.Ili kugundua substrates za parkin ambazo hazijasajiliwa, tulichagua protini saba zilizotambuliwa (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 na SNW1) na plasmidi zilizoambukizwa ili kuweka jeni hizi kwa HEK293T ya kawaida na kueleza kwa uthabiti matibabu ya miniSOG-Parkin na HEK293T ya HEK293T.Viwango vya protini za Ssu72 na SNW1 vilipunguzwa kwa kiasi kikubwa katika mstari wa miniSOG-Parkin (Mchoro 5e).Matibabu na CCCP kwa saa 12 ilisababisha uharibifu mkubwa zaidi wa substrates zote mbili.Ili kuchunguza kama uharibifu wa Ssu72 na SNW1 umewekwa na proteasome-ubiquitination, kizuizi cha proteasome MG132 kiliongezwa ili kuzuia shughuli za proteasome, na kwa kweli tuligundua kuwa mchakato wao wa uharibifu ulizuiwa (Mchoro 5f).Malengo ya ziada yasiyo ya substrate yalithibitishwa kama viingiliano vya Parkin kwa kutumia ukaushaji wa Magharibi (Kielelezo cha 10 cha Nyongeza), ambacho kilionyesha matokeo thabiti na LC-MS/MS.Kwa kumalizia, ujumuishaji wa mtiririko wa kazi wa PDPL na uthibitishaji wa uhamishaji wa protini unaolengwa huruhusu utambuzi wa substrates za ligase za E3 ambazo hazijasajiliwa.
Tumeunda jukwaa la kawaida la kuashiria ukaribu ambalo hukuruhusu kutambua katika nafasi na wakati POI zinazoingiliana.Jukwaa linatokana na protini miniSOG photosensitizer, ambayo ni takriban kDa 12 tu, chini ya nusu ya ukubwa wa kimeng'enya kilichokomaa cha APEX2 (27 kDa) na theluthi moja ya ukubwa wa TurboID (35 kDa).Ukubwa mdogo unapaswa kupanua kwa kiasi kikubwa anuwai ya programu za kusoma mwingiliano mdogo wa protini.Ugunduzi zaidi wa viboreshaji picha vya ziada, iwe ni protini zilizosimbwa kwa vinasaba au molekuli ndogo, unahitajika ili kuongeza kiwango cha mavuno ya oksijeni ya singlet na kupanua unyeti wa mbinu hii.Kwa toleo la sasa la miniSOG, azimio la juu la muda linaweza kupatikana kwa kutumia mwangaza wa samawati ili kuwezesha alama za ukaribu.Kwa kuongezea, muda mrefu zaidi wa mfiduo ulitoa "wingu" kubwa la oksijeni ya singlet, na kusababisha urekebishaji wa masalia ya distali ya histidine, kuongezeka kwa radius ya lebo, na uwezo wa kurekebisha azimio la anga la PDPL.Pia tulijaribu uchunguzi saba wa kemikali ili kuongeza uwiano wa mawimbi-msingi na tukagundua utaratibu wa molekuli nyuma ya mbinu hii.Mtiririko wa kazi wa TOP-ABPP pamoja na utafutaji wa wazi usio na upendeleo ulithibitisha kuwa marekebisho yalitokea tu katika histidines na hakuna microenvironment thabiti iliyozingatiwa kwa marekebisho yaliyoongezeka ya histidine, isipokuwa kwa upendeleo wa wastani wa histidines katika eneo la kitanzi.
PDPL pia imetumiwa kuangazia proteomu za seli ndogo zenye umaalumu wa proteome na ufunikaji angalau kulinganishwa na uwekaji lebo za ukaribu na mbinu za uchunguzi wa kemikali maalum za organelle.Alama za ukaribu pia zimetumika kwa mafanikio kubainisha uso, lysosomal, na proteomes zinazohusiana na secretome46,47.Tunaamini kuwa PDPL itaoana na seli hizi ndogo za seli.Zaidi ya hayo, tulitoa changamoto kwa PDPL kwa kutambua shabaha za ufungaji wa protini za sitosoli ambazo ni changamano zaidi kuliko protini zinazofunga utando kutokana na sifa zao zinazobadilika na kuhusika katika mwingiliano wa muda.PDPL ilitumika kwa protini mbili, kishirikishi cha transcriptional BRD4 na ligase E3 Parkin inayohusishwa na ugonjwa.Protini hizi mbili zilichaguliwa sio tu kwa kazi zao za kimsingi za kibaolojia, lakini pia kwa umuhimu wao wa kliniki na uwezo wa matibabu.Kwa POI hizi mbili, washirika wanaojulikana pamoja na walengwa ambao hawajasajiliwa walitambuliwa.Hasa, protini inayohusishwa na utengano wa awamu ilithibitishwa na ushirikiano wa IP, ambayo inaweza kuonyesha utaratibu mpya ambao BRD4 (isoform fupi) inadhibiti LLPS.Wakati huo huo, tunaamini kwamba kitambulisho cha substrates za Parkin ni hali ambayo kitambulisho cha adhesives zisizo za moja kwa moja inahitajika.Tulitambua substrates mbili za parkin ambazo hazijatambuliwa na kuthibitisha uharibifu wao kwenye njia ya ubiquitination-proteasome.Hivi majuzi, mkakati wa utegaji unaotegemea utaratibu umetengenezwa ili kugundua substrates za hydrolase kwa kuzinasa kwa vimeng'enya.Ingawa hii ni njia yenye nguvu sana, haifai kwa uchambuzi wa substrates zinazohusika katika uundaji wa tata kubwa na inahitaji uundaji wa vifungo vya ushirikiano kati ya enzyme na substrate.Tunatarajia kwamba PDPL inaweza kupanuliwa ili kuchunguza aina nyingine za protini na familia za vimeng'enya, kama vile familia za deubiquitinase na metalloprotease.
Aina mpya ya miniSOG, iitwayo SOPP3, imetengenezwa kwa kuboresha uzalishaji wa oksijeni wa singlet.Tulilinganisha miniSOG na SOPP3 na tukapata utendakazi ulioboreshwa wa kuashiria, ingawa uwiano wa mawimbi hadi kelele ulibakia bila kubadilika (Mchoro wa Nyongeza wa 11).Tulidhania kuwa uboreshaji wa SOPP3 (kwa mfano, kupitia mageuzi yaliyoelekezwa) ungesababisha protini bora zaidi za photosensitizer ambazo zinahitaji muda mfupi wa mwanga na hivyo kuruhusu michakato inayobadilika zaidi ya simu za mkononi kunaswa.Ni dhahiri, toleo la sasa la PDPL ni mdogo kwa mazingira ya seli kwa vile linahitaji mwanga wa bluu na haliwezi kupenya tishu za kina.Kipengele hiki kinazuia matumizi yake katika masomo ya mfano wa wanyama.Hata hivyo, mchanganyiko wa optogenetics na PDPL inaweza kutoa fursa kwa utafiti wa wanyama, hasa katika ubongo.Kwa kuongeza, photosensitizers zingine zilizobuniwa za infrared pia huondoa kizuizi hiki.Utafiti unaendelea katika eneo hili kwa sasa.
Laini ya seli ya HEK293T ilipatikana kutoka ATCC (CRL-3216).Laini ya seli ilijaribiwa kuwa haina maambukizi ya mycoplasma na ilikuzwa katika DMEM (Thermo, #C11995500BT) iliyoongezwa 10% ya seramu ya ng'ombe ya fetasi (FBS, Vistech, #SE100-B) na 1% penicillin/streptomycin (Hyclone, #SV30010).mzima ndani.
3-Aminophenylene (sampuli 3) na (4-ethynylphenyl)methanamine (sampuli 4) zilinunuliwa kutoka kwa Bidepharm.Propylamine (probe 2) ilinunuliwa kutoka Nishati-kemikali.N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (probe 1) iliundwa kulingana na mbinu zilizochapishwa.
Jedwali la Nyongeza la 1 linaorodhesha muundo wa kijenetiki uliotumika katika utafiti huu.Mifuatano ya miniSOG na KillerRed iliundwa kutoka kwa plasmid ya zawadi kutoka P. Zou (Chuo Kikuu cha Peking).Mfuatano wa ulengaji wa tumbo la mitochondrial ulitolewa kutoka kwa asidi 23 za amino za N-terminal za COX4 na kufanyizwa kwenye vekta zilizoonyeshwa kwa kutumia mkusanyiko wa Gibson (Beyotime, #D7010S).Ili kulenga utando na kiini cha retikulamu ya endoplasmic, DNA ya binadamu ya SEC61B (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) iliyokuzwa na PCR kutoka maktaba ya cDNA ya seli za HEK293T, na DNA ya H2B (iliyotolewa na D. Lin, Maabara ya Shenzhen Bay) na cloned , kama ilivyotajwa hapo juu.Isipokuwa ikiwa imeonyeshwa vinginevyo, jeni nyingine za protini zinazotumika kwa uhamisho na ujenzi wa laini za seli zilikuzwa PCR kutoka maktaba ya cDNA ya seli ya HEK293T.G3S (GGGS) na G4S (GGGGS) zilitumika kama viunganishi kati ya protini ya chambo na miniSOG.Lebo ya epitope ya V5 (GKPIPNPLLGLDST) iliongezwa kwa miundo hii ya muunganisho.Kwa kujieleza kwa mamalia na kuanzisha mstari thabiti wa seli, muundo wa muunganisho wa miniSOG uliwekwa ndani ya pLX304 vekta ya lentiviral.Kwa kujieleza kwa bakteria, miniSOG iliundwa katika vekta ya pET21a iliyoandikwa 6xHis kwenye C-terminus.
Seli za HEK293T zilipandwa kwenye seli 2.0 x 105 kwa kila kisima katika sahani sita za visima na kuhamishwa saa 24 baadaye na plasmidi za lentiviral (2.4 μg pLX304) na plasmidi za vifungashio vya virusi (1.5 μg psPAX2 na 1.2 μg00 pMD kwa kutumia Lipid 2) p. , #C0533), takriban 80% ya muunganisho.Baada ya kuambukizwa mara moja, njia ilibadilishwa na kuangaziwa kwa masaa 24 zaidi.Mkusanyiko wa virusi ulifanyika baada ya masaa 24, 48 na 72.Kabla ya kuambukizwa kwa mistari ya seli inayolengwa, njia ya virusi ilichujwa kupitia kichungi cha 0.8 μm (Merck, #millex-GP) na polybrene (Solarbio, #H8761) iliongezwa kwa mkusanyiko wa 8 μg/ml.Baada ya masaa 24, seli ziliruhusiwa kupona kwa kubadilisha kati.Seli zilichaguliwa kwa kutumia 5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) kwa vifungu vitatu vya kwanza kama uteuzi mgumu wa chini.Kisha ikatumika 20 μg/ml kama regimen kali zaidi kwa vifungu vitatu vinavyofuata.
Seli zilipandwa katika vyumba 12 vya visima (Ibidi, #81201) kwa msongamano wa takriban seli 20,000 kwa kila kisima.Ili kuboresha ushikamano wa seli za HEK293T, ongeza 50 µg/ml fibronectin (Corning, #356008) iliyoyeyushwa katika salini iliyoangaziwa ya fosfati (PBS, Sangon, #B640435) kwa 37°C.Vyumba vilitanguliwa kwa saa 1 na kisha kuondolewa kwa PBS.Baada ya saa 24, seli zilioshwa mara moja kwa kutumia PBS, na kuwekewa 1 mM probe 3 kwenye mmumunyo mpya wa chumvi uliosawazishwa wa Hanks (HBSS, Gibco, #14025092) kwa saa 1 ifikapo 37°C, na kisha kuingizwa na LED ya bluu (460 nm. )) ziliwashwa kwa dakika 10 kwa joto la kawaida.Baada ya hapo, seli zilioshwa mara mbili na PBS na kusawazishwa na 4% formaldehyde katika PBS (Sangon, #E672002) kwa dakika 15 kwa joto la kawaida.Formaldehyde ya ziada ilitolewa kutoka kwa seli zisizohamishika kwa kuosha mara tatu na PBS.Kisha seli zilipenyeza kwa 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) katika PBS na kuoshwa mara 3 kwa PBS.Kisha ondoa chemba na uongeze kwa kila sampuli 25 µl ya mchanganyiko wa athari ya kubofya iliyo na 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4 ) na 0.5 mg/ml sodiamu ascorbate (Aladdin, no. S105024) na incubated kwa dakika 30 kwa joto la kawaida.Baada ya majibu ya haraka, seli zilioshwa mara sita kwa PBS iliyo na 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) na kisha kuzuiwa kwa 5% BSA (Abcone, #B24726) katika PBST kwa dakika 30 kwenye joto la kawaida.
Kwa ukoloni wa kuzuia kinga, seli ziliwekwa na kingamwili za msingi kulingana na hali iliyoonyeshwa: panya anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), sungura anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), kingamwili ya kuzuia anti-calnexin ya sungura ya polyclonal (1:500, Abcam, #ab22595) au kingamwili ya sungura inayozuia lamin A/C (1:500; CST, #2032) saa 4 °C usiku mmoja.Baada ya kuosha mara 3 na PBST, seli ziliingizwa na kingamwili za pili: mbuzi wa kupambana na sungura Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) diluted 1:1000, mbuzi kupambana na panya Alexa Fluor 594 (CST, #8889) diluted 1:1000.dilution Punguza kwa joto la kawaida kwa dakika 30.Kisha seli zilioshwa mara 3 kwa PBST na kuzuiwa na DAPI (Thermo, #D1306) katika PBS kwa dakika 10 kwenye joto la kawaida.Baada ya kuosha mara 3 kwa kutumia PBS, seli zilifungwa kwa 50% ya glycerol (Sangon, #A600232) katika PBS kwa ajili ya kupiga picha.Picha za Immunofluorescent zilipatikana kwa kutumia darubini ya ZEISS LSM 900 Airyscan2 confocal na programu ya ZNE 3.5.
Kwa upigaji picha wa mwanga wa fluorescent wa oksijeni, seli zilioshwa mara mbili kwa bafa ya Hanks HEPES kabla ya kuongeza Si-DMA ya nM 100 katika bafa ya Hanks HEPES (DJINDO, #MT05).Baada ya kufichuliwa na mwanga, seli ziliwekwa ndani ya incubator ya CO2 ifikapo 37°C kwa dakika 45.Kisha seli zilioshwa mara mbili kwa bafa ya HEPES ya Hanks na kuzuiwa na Hoechst kwenye bafa ya HEPES ya Hanks kwa dakika 10 kwenye halijoto ya kawaida na kuonyeshwa kwa kutumia darubini ya ZEISS LSM 900 ya confocal., #M36008) katika bafa ya HBSS iliyo na kalsiamu na magnesiamu.Baada ya kukabiliwa na mwanga au doxorubicin (MCE, #HY-15142A), seli ziliwekwa ndani ya incubator ya CO2 ifikapo 37° C. kwa dakika 10, zikaoshwa mara mbili kwa bafa ya HBSS, na kuwekewa Hoechst katika bafa ya HBSS kwenye joto la kawaida.dakika.Doxorubicin ilitumika kama kidhibiti chanya cha uchunguzi ambapo seli zilitibiwa kwa 20 μM doxorubicin katika HBSS iliyo na 1% BSA kwa dakika 30.Picha za Immunofluorescent zilipatikana kwa kutumia darubini ya Zeiss LSM 900 confocal.
Seli za HEK293T zinazoonyesha mito-miniSOG kwa uthabiti zilipandwa kwa msongamano wa takriban 30% katika vyombo vya sentimita 15.Baada ya saa 48, wakati ~ 80% muunganisho ulipofikiwa, seli zilioshwa mara moja kwa PBS, zikawekwa ndani na 1 mm Probe 3 kwenye bafa mpya ya HBSS ndani kwa saa 1 kwa 37°C na kisha kuangaziwa na LED ya bluu kwa dakika 10 chumbani. joto..Baada ya hapo, seli zilioshwa mara mbili kwa PBS, kukwaruliwa na kusimamishwa tena kwenye bafa ya PBS isiyo na barafu iliyo na vizuizi vya protease visivyo na EDTA (MCE, #HY-K0011).Seli walikuwa lysed na sonicating ncha kwa dakika 1 (1 pili juu na 1 ya pili mbali katika amplitude 35%).Mchanganyiko uliopatikana ulitiwa centrifuged saa 15,871 xg kwa dakika 10 kwa 4°C ili kuondoa uchafu, na ukolezi wa nguvu kupita kiasi ulirekebishwa hadi 4 mg/mL kwa kutumia kifaa cha kupima protini cha BCA (Beyotime, #P0009).Changanya ml 1 ya lysate iliyo hapo juu na biotin azidi 0.1 mM inayoweza kuharibika (Confluore, #BBBD-14), TCEP 1 mM (Sangon, #A600974), ligand ya TBTA ya 0.1 mm (Aladdin, #T162437), na mM 1 CuSO4 incuba ya chini. kuzunguka kwa saa 1 kwa joto la kawaida.Baada ya majibu ya haraka, ongeza mchanganyiko kwenye myeyusho uliochanganyika awali (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) kwenye bakuli la glasi yenye mililita 10.Sampuli zilichanganywa na centrifuged saa 4500 g kwa dakika 10 kwa joto la kawaida.Suluhisho la chini na la juu lilitupwa, mvua ilioshwa mara mbili na 1 ml ya methanoli na centrifuged saa 15871 × g kwa dakika 5 kwa 4 ° C.Ongeza 1 ml ya 8 M urea (Aladdin, no. U111902) katika 25 mm ammonium bicarbonate (ABC, Aladdin, no. A110539) ili kufuta mvua.Sampuli ziliundwa upya kwa 10 mm dithiothreitol (Sangon, #A100281 katika 25 mm ABC) kwa dakika 40 kwa 55°C na kufuatiwa na kuongezwa kwa iodoacetamide safi ya mm 15 (Sangon, #A600539) kwenye joto la kawaida gizani.Alkylation ndani ya dakika 30..Dithiothreitol ya ziada ya mm 5 iliongezwa ili kukomesha majibu.Tayarisha takriban 100 µl NeutrAvidin agarose shanga (Thermo, #29202) kwa kila sampuli kwa kuosha mara 3 kwa 1 ml PBS.Suluhisho la proteome hapo juu lilipunguzwa kwa 5 ml PBS na kuingizwa na shanga za agarose za NeutrAvidin zilizooshwa kwa saa 4 kwa joto la kawaida.Kisha shanga zilioshwa mara 3 na 5 ml PBS yenye 0.2% SDS (Sangon, #A600485), mara 3 na 5 ml PBS yenye urea 1M, na mara 3 na 5 ml ddH2O.Kisha shanga hizo zilivunwa kwa kutumia centrifugation na kusimamishwa tena katika 200 μl ya 25 mm ABC yenye 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) na 20 ng/μl trypsin (Promega, #V5280).Jaribu usiku kucha kwa 37°C kwa mzunguko.Mwitikio huo ulisimamishwa kwa kuongeza asidi ya fomu (Thermo, # A117-50) hadi pH ifikie 2-3.Shanga zilioshwa mara 3 na 1 ml ya PBS iliyo na 0.2% SDS, mara 3 na 1 ml ya PBS iliyo na urea 1 M, na kisha mara 3 na 1 ml ya maji yaliyotengenezwa.Peptidi zilizorekebishwa zilitolewa na lysis nyepesi (365 nm) kwa dakika 90 kwa kutumia 200 μl ya 70% MeOH.Baada ya centrifugation, supernatant ilikusanywa.Kisha shanga zilioshwa mara moja kwa 100 μl ya 70% MeOH na nguvu kuu ziliunganishwa.Sampuli zilikaushwa kwenye kontena ya utupu ya Speedvac na kuhifadhiwa kwa -20 ° C hadi uchambuzi.
Ili kutambua na kuhesabu peptidi zilizobadilishwa za oksijeni ya singleti, sampuli ziliyeyushwa upya katika 0.1% ya asidi ya fomu na 1 μg ya peptidi zilichanganuliwa kwa kutumia kipima sauti cha Orbitrap Fusion Lumos Tribrid kilicho na chanzo cha nano ESI kutoka Tune na Xcalibur kutoka kwa programu ya muuzaji 4.3.Sampuli zilitenganishwa kwenye safu wima ya kapilari yenye 75 µm × 15 cm iliyopakiwa ndani yenye nyenzo 3 µm C18 (ReproSil-pur, #r13.b9.) na kuunganishwa kwenye mfumo wa EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).Peptidi zilitenganishwa na kromatografia ya gradient ya dakika 95 kutoka 8% ya kutengenezea B hadi 50% kutengenezea B (A = 0.1% asidi ya fomu katika maji, B = 0.1% asidi ya fomu katika 80% asetonitrile), kisha ikaongezeka kwa mstari hadi 98% B dakika. katika dakika 6 kwa kiwango cha mtiririko wa 300 nl / min.Orbitrap Fusion Lumos hukusanya data kwa kubadilisha kati ya scan kamili ya MS na MS2 scan kulingana na data.Voltage ya kunyunyiza iliwekwa kuwa 2.1 kV na halijoto ya kapilari ya usafiri wa ioni ilikuwa 320°C.MS spectra (350-2000 m/z) zilikusanywa kwa azimio la 120,000, AGC 4 × 105, na muda wa juu zaidi wa ingizo wa 150 ms.Vitangulizi 10 vya kawaida vinavyochajiwa katika kila skanisho kamili viligawanywa kwa kutumia HCD yenye nishati ya mgongano ya kawaida ya 30%, dirisha la kutengwa kwa quadrupole la 1.6 m/z, na mpangilio wa azimio wa 30,000.Lengo la AGC la tandem mass spectrometry kwa kutumia 5×104 na muda wa juu zaidi wa kuingiza 150 ms.Ubaguzi unaobadilika umewekwa kuwa sekunde 30. Ioni ambazo hazijakabidhiwa au zinazotozwa 1+ na >7+ zilikataliwa kwa MS/MS. Ioni ambazo hazijakabidhiwa au zinazotozwa 1+ na >7+ zilikataliwa kwa MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ na >7+ были отклонены для МС/МС. Ayoni au ayoni ambazo hazijakabidhiwa zenye malipo ya 1+ na >7+ zilikataliwa kwa MS/MS.未指定的离子或电荷為1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷為1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ na >7+ были отклонены для МС/МС. Ayoni au ayoni ambazo hazijabainishwa zenye malipo ya 1+ na >7+ zilikataliwa kwa MS/MS.
Data ghafi inachakatwa kwa kutumia mfumo wa kompyuta wa FragPipe kulingana na MSFragger.Upendeleo mkubwa na asidi ya amino inayolingana iliamuliwa kwa kutumia algoriti ya utafutaji iliyo wazi na uvumilivu wa wingi wa mtangulizi wa -150 hadi 500 Da.Peptidi zilizobadilishwa zilitambuliwa kwa kutumia marekebisho ya histidine na faida kubwa ya +229.0964 na +247.1069 Da katika PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Seli zinazoonyesha kwa uthabiti jeni iliyounganishwa ya miniSOG ziliwekwa katika vyombo vya sentimita 6.Baada ya kufikia ~ 80% muunganisho, seli zilioshwa mara moja kwa HBSS (Gibco, #14025092), kisha kuangaziwa kwa uchunguzi wa kemikali katika HBSS kwa saa 1 kwa 37°C na kuangaziwa na mwanga wa bluu.10W LED kwa dakika 20 kwa joto la kawaida.Ili kubainisha ni aina gani ya spishi tendaji za oksijeni zinazohusika katika PDPL, 0.5 mM vitamini C (MCE, #HY-B0166), 5 mm Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) , 100 mm mannitol (Kemikali ya Nishati, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 iliongezwa kwenye seli kama virutubisho.Baada ya kuosha na PBS baridi, seli zilifutwa, zilizokusanywa katika mirija ya 1.5 ml ya centrifuge, na kuunganishwa kwa ncha kwa dakika 1 katika 200 μl ya PBS na kizuizi cha 1x cha protease bila EDTA (1 s na 1 s bila, amplitude 35%).Mchanganyiko uliotolewa ulitiwa centrifuged kwa 15,871 × g kwa dakika 10 kwa 4 °C na ukolezi wa nguvu kupita kiasi ulirekebishwa hadi 1 mg/mL kwa kutumia kifaa cha kupima protini cha BCA.Takriban 50 µl ya lisate iliyo hapo juu iliwekewa 0.1 mM rhodamine azide (Aladdin, nambari T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, na 1 mm CuSO4 kwa saa 1 kwa joto la kawaida na mzunguko kutoka chini hadi juu.Baada ya kubofya, kunyesha kwa asetoni kulifanywa kwa kuongeza 250 μl ya asetoni kabla ya baridi kwenye sampuli, incubating saa -20°C kwa dakika 20 na centrifuging saa 6010×g kwa dakika 10 kwa 4°C.Kusanya pellet na chemsha katika 50 µl ya 1x bafa ya Laemmli kwa dakika 10 kwa 95 °C.Kisha sampuli zilichanganuliwa kwenye jeli ndefu za SDS-PAGE na kuonyeshwa kwa kutumia mfumo wa upigaji picha wa Bio-rad ChemiDoc MP Touch na programu ya Image Lab Touch.
Udhihirisho na utakaso wa protini inayojumuisha miniSOG-6xHis ulifanywa kama ilivyoelezwa hapo awali.Kwa ufupi, seli za E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) zilibadilishwa na pET21a-miniSOG-6xHis na usemi wa protini ulitokana na 0.5 mm IPTG (Sangon, #A600168).Baada ya uchanganuzi wa seli, protini zilisafishwa kwa kutumia shanga za agarose za Ni-NTA (MCE, no. 70666), kusafishwa dhidi ya PBS, na kuhifadhiwa kwa -80°C.
Kwa kipimo cha ukaribu cha lebo ya in vitro, changanya 100 μM purified miniSOG, 1 mM probe 3, na 1 μg anti-lebo ya kingamwili monokloni ya kipanya (TransGen, #HT501-01) katika PBS hadi jumla ya majibu ya ujazo wa 50 μl..Mchanganyiko wa athari uliangaziwa na taa ya bluu ya LED kwa dakika 0, 2, 5, 10 na 20 kwa joto la kawaida.Mchanganyiko huo uliwekwa kwa 0.1 mM biotin-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, na 1 mm CuSO4 kwa h 1 kwa joto la kawaida kwenye kitetemeshi kinachoenda juu.Baada ya majibu ya haraka, ongeza bafa 4x ya Laemmli moja kwa moja kwenye mchanganyiko na uichemke kwa 95°C kwa dakika 10.Sampuli zilichanganuliwa kwenye jeli za SDS-PAGE na kuchambuliwa na ufutaji wa magharibi wenye streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Peptidi sanisi iliyo na histidine iliyo na C-terminal amidation (LHDALDAK-CONH2) ilitumiwa kuchanganua uwekaji lebo wa peptidi iliyo karibu kulingana na vitro.Katika tathmini hii, 100 μM iliyosafishwa miniSOG, 10 mM probe 3 na 2 μg/ml peptidi synthetic zilichanganywa katika PBS katika jumla ya majibu kiasi cha 50 μl.Mchanganyiko wa majibu uliangaziwa na taa ya bluu ya LED kwa saa 1 kwenye joto la kawaida.Mikrolita moja ya sampuli ilichanganuliwa kwa kutumia mfumo wa LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight mass spectrometer na programu ya uchanganuzi wa masafa ya MassLynx).
Seli za HEK293T zinazoonyesha kwa uthabiti jeni la muunganisho la miniSOG zilipandwa katika vyombo vya sentimita 10 kwa mistari iliyo na ujanibishaji wa viungo tofauti (Mito, ER, Nucleus) na sahani za sentimita 15 za mistari ya Parkin-miniSOG na BRD4-miniSOG.Baada ya kufikia ~ 90% muunganisho, seli zilioshwa mara moja kwa HBSS, kisha kuingizwa kwa probe 3 katika HBSS kwa saa 1 kwa 37°C na kuangaziwa kwa LED 10 W bluu kwenye joto la kawaida.Kwa uwekaji lebo ya Parkin isiyo na mtu, 10 µM protoni carbonyl sianidi carrier m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) yenye uchunguzi 3 katika HBSS iliongezwa kwa saa 1 kwa 37°C.Uchanganuzi wa seli, kemia ya kubofya, kupunguza na hatua za alkylation zilikuwa sawa na ilivyoelezwa hapo juu, isipokuwa kwamba miligramu 2 za lysate ziliongezwa na azide ya biotini PEG3 ilitumika katika mibofyo ya kubofya badala ya azide ya biotin inayoweza kuharibika.Baada ya uboreshaji, shanga zilioshwa mara 3 na 5 ml ya PBS iliyo na 0.2% SDS, mara 3 na 5 ml ya PBS iliyo na urea 1 M, na mara 3 na 5 ml ya PBS.Baada ya hapo, 2 µg trypsin iliongezwa kwa 300 µl 25 mM ABC yenye 1 M urea ili kupasua protini usiku mmoja kwa 37°C.Mmenyuko huo ulisimamishwa kwa kuongeza asidi ya fomu hadi pH ya 2-3 ilifikiwa.Baada ya trypsinization kwenye shanga, myeyusho wa peptidi ulitolewa kwa kutumia safu wima ya SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) na kukaushwa kwenye kikontakta cha utupu cha Speedvac.Peptidi ziliyeyushwa upya katika asidi ya fomu 0.1% na ng 500 za peptidi zilichanganuliwa kwa kutumia spectrometa ya molekuli ya Orbitrap Fusion Lumos Tribrid iliyo na chanzo cha nano-ESI kilichoelezwa hapo juu.Peptidi zilitenganishwa kwenye safu za awali za RP-HPLC za kibiashara (75 μm x 2 cm) (Thermo, no. 164946) na safu wima za uchambuzi za RP-HPLC (75 μm x 25 cm) (Thermo, no. 164941), zote zimejaa 2 μm.gradient kutoka 8% hadi 35% ACN katika dakika 60, kisha linearly kuongezeka hadi 98% B katika dakika 6 kwa kiwango cha mtiririko wa 300 Nl/min.MS spectra (350-1500 m/z) zilikusanywa kwa azimio la 60,000, AGC 4 × 105, na muda wa juu zaidi wa ingizo wa 50 ms.Ioni zilizochaguliwa ziligawanywa kwa mpangilio na HCD katika mizunguko ya 3 na nishati ya kawaida ya mgongano ya 30%, dirisha la kutengwa la quadrupole la 1.6 m/z, na azimio la 15000. Lengo la AGC la 5 × 104 tandem sanjari na muda wa juu zaidi wa kudunga. ya 22 ms zilitumika.Utengaji unaobadilika umewekwa kuwa sekunde 45. Ioni ambazo hazijakabidhiwa au zinazotozwa 1+ na >7+ zilikataliwa kwa MS/MS. Ioni ambazo hazijakabidhiwa au zinazotozwa 1+ na >7+ zilikataliwa kwa MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ na >7+ были отклонены для МС/МС. Ayoni au ayoni ambazo hazijakabidhiwa zenye malipo ya 1+ na >7+ zilikataliwa kwa MS/MS.未指定的离子或电荷為1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷為1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ na >7+ были отклонены для МС/МС. Ayoni au ayoni ambazo hazijabainishwa zenye malipo ya 1+ na >7+ zilikataliwa kwa MS/MS.
Hatua za maandalizi ya sampuli hadi uboreshaji wa shanga za NeutrAvidin zilikuwa sawa na katika uchambuzi wa LC-MS/MS ulioelezwa hapo juu.Takriban 50 μg ya lysate ilitumika kama pembejeo kwa udhibiti wa upakiaji na 2 mg ya lysate ilitumiwa kwa mibofyo ya kubofya.Baada ya kuimarisha na kuosha kwa neutravidin, protini zilizounganishwa ziliondolewa kwa kuongeza 50 μl ya bafa ya Laemmli kwenye shanga za resin ya agarose na kuchemsha kwa 95 ° C. kwa dakika 5.Ingizo la udhibiti wa upakiaji na sampuli zilizoboreshwa za shanga zilichanganuliwa na SDS-PAGE na kuhamishiwa kwenye membrane za PVDF (Millipore, #ISEQ00010) kwa mbinu za kawaida za Magharibi.Utando huo ulizuiliwa na 5% ya maziwa ya skim (Sangon, #A600669) katika TBS yenye 0.1% kati ya 20 (TBST) na kuingizwa kwa mfuatano na kingamwili za msingi na za pili.Kingamwili msingi ziliyeyushwa 1:1000 katika 5% ya maziwa ya skim katika TBST na kuangaziwa mara moja kwa 4°C.Kingamwili za sekondari zilitumiwa kwa uwiano wa 1:5000 na kuingizwa kwa saa 1 kwenye joto la kawaida.Utando huo ulionyeshwa na chemiluminescence kwa kutumia mfumo wa picha wa Mbunge wa Chemidoc.Uchanganuzi wote ambao haujakatwa wa bloti na jeli kwenye takwimu huwasilishwa kama data ghafi.
Kingamwili za msingi zilizotumika katika utafiti huu zilijumuisha kingamwili ya sungura inayozuia SFPQ (CST, no. 71992), kingamwili ya sungura ya kupambana na FUS (CST, no. 67840), sungura ya kupambana na NSUN2 polyclonal antibody (Proteintech, no. 20854-1- AP), anti-mSin3A kingamwili ya polyclonal ya sungura (Abcam, #ab3479), kingamwili monokloni ya panya (TransGen, #HT201-02), anti-β-actin monoclonal antibody (TransGen, #HC201-01), kinza sungura. -CDK2 kingamwili ya monoclonal (ABclonal, #A0094), kingamwili ya sungura monoclonal hadi CTBP1 (ABclonal, #A11600), kingamwili ya polyclonal ya sungura hadi DUT (ABclonal, #A2901), kingamwili ya sungura ya polyclonal hadi PSMC4 (ABclonal anti-5), #Abclonal DNAJB1 kingamwili ya polyclonal (ABclonal, # A5504).Kingamwili hizi zilitumika kwa dilution ya 1:1000 katika maziwa ya skim 5% katika TBST.Kingamwili za upili zilizotumika katika utafiti huu zilijumuisha IgG ya kuzuia sungura (TransGen, #HS101-01), IgG ya kupambana na panya (TransGen, #HS201-01) katika dilution ya 1:5000.
Ili kuchunguza zaidi ikiwa BRD4 inaingiliana na SFPQ, seli thabiti za HEK293T na BRD4-miniSOG zinazozidisha HEK293T ziliwekwa katika sahani za sentimita 10.Seli zilioshwa na PBS baridi na kuwekwa kwenye 1 ml Pierce IP lysis buffer (Thermo Fisher, #87787) kwa kizuia protease isiyo na EDTA kwa dakika 30 kwa 4°C.Baada ya hapo, lysates zilikusanywa katika mirija ya 1.5 ml ya centrifuge na centrifuged saa 15,871 xg kwa dakika 10 kwa 4 ° C.Dawa ya juu ilivunwa na kuwekewa 5 µg ya anti-V5 yenye lebo ya kingamwili ya panya (CST, #80076) usiku mmoja saa 4°C.Osha takriban 50 µl za protini A/G shanga za sumaku (MCE, #HY-K0202) mara mbili kwa PBS iliyo na 0.5% Kati-20.Kisha lysates za seli ziliingizwa na shanga za magnetic kwa saa 4 saa 4 ° C na mzunguko kutoka chini hadi juu.Kisha shanga zilioshwa mara nne na 1 ml ya bafa ya PBST na kuchemshwa kwa 95 ° C kwa dakika 5.Sampuli zilichanganuliwa kwenye jeli za SDS-PAGE na kuhamishiwa kwenye utando wa PVDF kwa kutumia mbinu za kawaida za Magharibi.Utando ulizuiliwa katika maziwa ya skim 5% katika TBST na kuingizwa kwa mfuatano na kingamwili za msingi na za upili.Kingamwili Kingamwili cha Kingamwili cha Msingi cha Sungura ya kuzuia SFPQ (CST, #71992) ilitumiwa kwa uwiano wa 1:1000 katika maziwa ya skim ya 5% katika TBST na kuanikwa usiku kucha kwa 4°C.IgG ya kupambana na sungura ilitumiwa kwa uwiano wa 1: 5000 na incubated kwa saa 1 kwa joto la kawaida.Utando huo ulionyeshwa na chemiluminescence kwa kutumia mfumo wa picha wa Mbunge wa Chemidoc.
Miundo yote iliyotumika kwa uchanganuzi wa Maeneo ya Uso wa Kupitika ya Kumulika (SASA) ilipatikana kutoka Benki ya Data ya Protini (PDB)52 au Hifadhidata ya Muundo wa Protini ya AlphaFold53.SASA kamili ilikokotolewa kwa kila masalio kwa kutumia mpango wa FreeSASA.Data kamili na isiyo na utata ya SASA pekee ya histidine iliyo na alama na majirani zake ndiyo iliyotumiwa kupata wastani wa SASA kwa kila muundo.Ufikivu wa viyeyusho vya jamaa (RSA) kwa kila histidine ulikokotolewa kwa kugawanya thamani kamili ya SASA na upeo wa juu wa kimajaribio unaowezekana wa uso wa mabaki unaopatikana kwa kutengenezea.Kisha histidine zote ziliainishwa kama zilizofichwa ikiwa wastani wa RSA ulikuwa chini ya 20%, vinginevyo uliwekwa wazi56.
Faili ghafi zilizopatikana katika hali ya DDA zilitafutwa kwa kutumia Proteome Discoverer (v2.5) au MSfragger (Fragpipe v15.0) katika hifadhidata ifaayo ya protini iliyothibitishwa ya SwissProt iliyo na vichafuzi vya kawaida.Peptidi zilihitaji trypsin kamili na tovuti mbili za kupasuka, carbamoyl methylation kama marekebisho ya kudumu na oxidation ya methionine kama marekebisho ya nguvu.Ustahimilivu wa uzito wa kitangulizi na sehemu uliwekwa kuwa 10 ppm na 0.02 Da (MS2 Orbitrap), mtawalia. Vipigo vya uchafu viliondolewa, na protini zilichujwa ili kupata kiwango cha ugunduzi wa uwongo cha <1%. Vipigo vya uchafu viliondolewa, na protini zilichujwa ili kupata kiwango cha ugunduzi wa uwongo cha <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент ложного обнаружения <1%. Vidonge vichafuzi viliondolewa na protini kuchujwa ili kutoa kiwango cha ugunduzi wa uwongo cha <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаружений <1%. Vipigo vichafuzi viliondolewa na protini kuchujwa ili kufikia kiwango chanya cha uwongo cha <1%.Kwa uchambuzi wa kiasi bila matumizi ya maandiko, maudhui ya protini ya kawaida kutoka kwa marudio matatu ya kibiolojia yalitumiwa.Uchambuzi wa ujanibishaji wa seli ndogo za protini ulifanywa kwa kutumia uchambuzi wa Gene Ontology (GO) kutoka kwa DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 na hifadhidata zilizokusanywa na kuchapishwa na kikundi cha Alice Ting.Ramani ya volkano ilipatikana kutoka kwa Perseus (v1.6.15.0). Mabadiliko ya wingi wa protini yalijaribiwa kwa umuhimu wa takwimu kwa kutumia jaribio la pande mbili la t, na mapigo ya protini yalitambuliwa kwa mabadiliko ya wingi >2 (isipokuwa ikiwa imeelezwa vinginevyo) na thamani ya p <0.05. Mabadiliko ya wingi wa protini yalijaribiwa kwa umuhimu wa takwimu kwa kutumia jaribio la pande mbili la t, na mapigo ya protini yalitambuliwa kwa mabadiliko ya wingi >2 (isipokuwa ikiwa imeelezwa vinginevyo) na thamani ya p <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Mabadiliko ya mkunjo wa maudhui ya protini yalijaribiwa kwa umuhimu wa takwimu kwa kutumia mtihani wa t wenye mikia miwili, na ulinganifu wa protini ulitambuliwa na mabadiliko ya maudhui >2 (isipokuwa imebainishwa vinginevyo) na thamani ya ap <0.05.使用 双边 T 检验 测试 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 并 并 确定 蛋白质 命 的 丰度使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 倍数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 倍数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 中 嘉 星 5 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Umuhimu wa kitakwimu wa mabadiliko yanayokunjwa katika maudhui ya protini ulijaribiwa kwa kutumia kipimo cha t chenye mikia miwili, na ulinganifu wa protini ulibainishwa kwa mabadiliko ya maudhui >2 (isipokuwa imeonyeshwa vinginevyo) na thamani za p <0.05.Uchanganuzi wa mwingiliano wa protini ulifanywa kwa kutumia uchanganuzi wa GO pamoja na hifadhidata ya String.
Nakala tatu za kibaolojia zilifanywa na matokeo sawa.Uchambuzi wa takwimu ulifanyika kwa GraphPad Prism (programu ya GraphPad) na viwanja vya volkano vilitolewa na Perseus (v1.6.15.0).Ili kulinganisha vikundi hivyo viwili, thamani za p zilibainishwa kwa kutumia mtihani wa t wa Mwanafunzi wenye mikia miwili.Protini za singleton tu zilizotambuliwa angalau mara mbili katika kikundi cha majaribio zilijumuishwa kwenye viwanja vya volkano, na maadili yanayolingana yaliyokosekana katika kikundi cha kudhibiti yalibadilishwa na Perseus kutoka kwa usambazaji wa kawaida ili thamani ya p iweze kuhesabiwa.Pau za hitilafu zinawakilisha wastani wa ± mkengeuko wa kawaida.Katika uchanganuzi wa protini kwa uchanganuzi wa takwimu, wingi wa protini ambazo zilionekana katika angalau nakala mbili za kibaolojia zilihifadhiwa.Mbinu za takwimu hazikutumika kubainisha mapema ukubwa wa sampuli.Majaribio si ya kubahatisha.Watafiti hawakuwa vipofu kwa kazi wakati wa majaribio na tathmini ya matokeo.
Kwa habari zaidi juu ya muundo wa utafiti, angalia muhtasari wa Ripoti ya Utafiti wa Mazingira iliyounganishwa na nakala hii.
Data ya spectrometry ya wingi iliyopatikana katika utafiti huu iliwasilishwa kwa ProteomeXchange Consortium kupitia hazina ya washirika wa iProX57 chini ya seti ya data ID PXD034811 (seti ya data ya PDPL-MS).Data ghafi hutolewa katika mfumo wa faili ghafi za data.Nakala hii inatoa data asili.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Kufahamiana na ujirani: kutumia biotinini inayotegemea ukaribu ili kubainisha muundo wa protini na viungo vya ramani. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Kufahamiana na ujirani: kutumia biotinini inayotegemea ukaribu ili kubainisha muundo wa protini na viungo vya ramani.Gingras, AS, Abe, KT na Raut, B. Kuzoeana na mazingira: kutumia biotini inayotegemea ukaribu ili kubainisha changamano za protini na organelles za ramani. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化來表征蛋白质复合物并绘制细。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Kuelewa ujirani: tumia utegemezi wa jirani kwenye maisha ya kibaolojia.Gingras, AS, Abe, KT na Raut, B. Kuelewa ukaribu: sifa za muundo wa protini na uchoraji wa ramani za organelles kwa kutumia biotinylation inayotegemea ukaribu.Sasa.Maoni yangu.Kemikali.biolojia 48, 44–54 (2019).
Geri, JB na wengine.Kuchora mazingira madogo kwa kuhamisha nishati ya Dexter kwa seli za kinga.Sayansi 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL na wengine.Mitandao ya vipimo viwili vya protini hugundua urekebishaji upya wa seli mahususi wa mwingiliano wa binadamu.Visanduku 184, 3022–3040.e3028 (2021).